تطفير

Mutagenesis -

التطفير

وفاء شومان

التطفير مخبرياً و أهميته

المطفّرات وآليات التطفير

أنواع التطفير وطرائق الكشف عن الطفرات

يُعدّ التطفير Mutagenesis الحادثة المسـؤولة عـن إحداث الطفرات بهدف دراستها والاستفادة منها، وتُعرَّف الطفرات mutations بأنها تغيير مفاجئ بالمادة الوراثية يُورَّث إلى الأجيال المتتالية. وقد يكون هذا التغيير صغيراً جداً، فيؤثر في نوكليوتيد واحد أو في عدة نوكليوتيدات في جين ما، أو في عدة جينات، أو يكون كبيراً، فيؤثر في قطع كبيرة من الصبغيّات، أو حتى كامل الصبغيات في الفرد، وقد اعتمدت التعابير التالية في تصنيف الطفرات:

أ- الطفرة المورثية: gene mutation تصيب جيناً واحداً، وقد يعود التغيير الذي يُورَّث إلى تغيير زوج واحد من النوكليوتيدات، سواء بالاستبدال التبادلي transversions أم بالاستبدال الانتقالي transitions أم بزيادة أو نقص بنوكليوتيد واحد أو بعدة نوكليوتيدات؛ مما قد يؤدي إلى تغيير في مجال إطار القراءة reading frame التي تترجم إلى حموض أمينية، فتؤثر في البروتين الناتج، ومن ثمّ تغيير الصفة المحكومة بهذا الجين.

ب - الطفرات الصبغية التي تصيب مجموعة من الجينات سواء كانت محمولة على صبغي واحد أم على عدة صبغيات، وقد تعود التغيرات إما إلى فقد أجزاء من الصبغي (حذف deletion)؛ وإمّا إلى إدخال قطع إضافية إليه (insertion)؛ وإمّا إلى تبادل أماكن بعض القطع على الصبغي نفسه (الانقلاب inversion) أو على صبغيات مختلفة (الانتقال translocation).

ج- الطفرة المجينية (الجينومية) genome mutation: وهي التي تصيب عدداً من الصبغيات في الخلية من دون تغيير في بنيتها، وتؤدي إلى حالات متعددة الصيغ الصبغية polyploidy سواء كانت حقيقية الصيغة الصبغية euploidy أم مختلة الصيغة الصبغية aneuploidy.

يمكن أن تحدث الطفرات تلقائياً وعفوياً spontaneous mutations من دون تدخل الإنسان، وقد تكون طفرات صنعية مُتَحكَّماً بها يجري تحفيزها باستخدام مواد أو عوامل مطفِّرة mutagens، كبعض المواد الكيميائية أو بعض الأشعة أو غيرها من مسببات الطفرات، وهذه هي عملية التطفير.

يرى بعض الباحثين أن المفهوم الحقيقي للطفرة يتناول الطفرات المورثية حصراً، وما دون ذلك من تبدلات صبغية أو عددية ما هو إلا زيوغ صبغية chromosome aberrations أو تبدلات عددية للصبغيات.

التطفير مخبرياً و أهميته

هو تقنية تتضمن معاملة معيّنة للدنا (هندسته) بهدف إنتاج جين طافر، أو بروتين جديد، أو سلالة بكترية جديدة، أو أي كائن مُحوَّر وراثياً. يمكن أن يجري تطفير أي من مكونات الجين سواء عناصر المراقبة التي تتحكم بعملها أم المنطقة المشفَّرة التي تتحكم بما ينجم عن ترجمتها؛ مما يسمح بالدراسة التفصيلية للجين وبمعرفة الوظيفة المحدِّدة لها أو البروتين الذي يمكن أن تُنْتِجه. وقد تُنْتج الطفرة أيضاً بروتينات طافرة تتميز بصفات مهمة، كما يمكن أن تحفِّز وظائف جديدة وقد تكون ذات أهمية اقتصادية. ويمكن أن يكون للسلالات البكتريا الطافرة تطبيقات عملية وأهمية اقتصادية، أو أن تسمح بالتعرف إلى الأساس الجزيئي لوظيفة خلوية خاصة.

الأساس العلمي للتطفير

يعمل التطفير على إحداث نسبة الطفرات و/أو زيادتها بتهيئة الشروط التي تعمل على تغيير الدنا، حيث تقوم العوامل المطفِّرة بإدخال بعض التغيرات الكيميائية على جزيئة الدنا، كتغيير في القواعد الآزوتية، أو كسر الروابط بين السكر ومجموعة الفسفات، وتُعدّ هذه الخطوات المرحلة الأولية التي تهيئ لحدوث الطفرة premutational lesion، حيث يظهر تعبير الطفرة فعلاً بعد عملية انحراف، وتغيير في بعض العمليات الخلوية كتناسخ الدنا أو إعادة التأشيب recombination والتي تؤدي إلى ظهور صفات جديدة.

المطفّرات وآليات التطفير

تُعرَّف المطفّرات بأنها عوامل كيميائية أو فيزيائية تعمل على إحداث تغيرات بالمادة الوراثية للكائنات الحية تتسبب في حدوث الطفرات أو في زيادة نسبتها في مجتمع ما، وهناك عدة أنواع من المطفّرات:

1- الأشعة: هي أول أنواع المطفرات المعروفة، وورد أول تقرير عن أثرها في الجينات عام 1920. تتباين الأشعة في أطوالها التي تتناسب عكساً مع الطاقة التي تحملها. وتُعدّ الأشعة فوق البنفسجية UV والأشعة الأعلى طاقة منها الأشعة الأهم من الناحية البيولوجية. وقد تكون الأشعة مؤيِّنة، كما هي حال أشعة X وأشعة غاما، حيث تؤدي طاقتهما إلى إنتاج إيونات (شوارد) نشيطة عندما تتفاعل مع الجزيئات البيولوجية. أما الأشعة غير المؤيِّنة (فوق البنفسجية) فتُحدث طفرات نتيجة امتصاصها من قبل جزيئات الدنا والبروتينات. فمثلاً تُحدِث أشعة X (أشعة مؤينة) كسوراً في جزيئة الدنا، وتحاول إصلاح هذه الكسور من خلال التأشيب الذي يؤدي بدوره إلى تغيرات وراثية كبيرة، مثل حذف قطع من الصبغيات أو تغيير مواقعها أو إعادة تجميع أجزاء الصبغيات المتكسرة بترتيبات جديدة chromosomal rearrangements.

أما الأشعة فوق البنفسجية ultraviolet فهي ليست مؤينة، ولكنها تتفاعل مع الدنا وجزيئات بيولوجية أخرى، وتُعدّ من العوامل المطفّرة فهي تُمْتص من القواعد الآزوتية في جزيئات الدنا ومن الحموض الأمينية العطرية في البروتينات. وتعمل أشعة UV-B وUV-C على تحريض اتحاد قواعد البيريميدين المتجاورة معطية ثنائيات البيريميدين ومنتجة طفرات موضعية. ويمكن أن تنتج جميع الارتباطات المحتملة للبيريميدينات (T-T, T-C, C-T and C-C) إلا أن الثنائي T-T هو الأكثر شيوعاً. أما أكثر منتجات الطفرات المتسببة عن الأشعة فوق البنفسجية وفرة فهي ثنائيات البيريميدين سيكلوبوتان .pyrimidine cyclobutane dimers وتعمل كل ثنائية سيكلوبوتان على تأخير (إعاقة) عمل إنزيم بلمرة الـ DNA؛ وعلى الرغم من أن الإنزيم يستمر أحياناً بالتصنيع متجاوزاً الثنائية، ولكنه يُدخل عندئذٍ الأساس الآزوتي غير الصحيح بدلاً من الصحيح. إن أكثر نماذج الطفرات المحدثة بالأشعة فوق البنفسجية تكراراً هي الانتقالات transitions متبوعة بنوع آخر من الطفرات النقطية (المورثية) point mutations. استُخدمت الأشعة فوق البنفسجية في العديد من الدراسات الجزيئية الأولية لدراسة آلية نشوء الطفرات وفهمها؛ والتخريب الذي يصيب الـ DNA، لذلك هناك معلومات غزيرة عن أثر هذه الأشعة في جزيئة الـ .DNA

2- المركّبات الكيميائية: تصنف هذه المطفّرات ضمن أربع مجموعات؛ اعتماداً على الآلية التي تؤثر بها في الـ DNA:

أ- قواعد مماثلة base analogues: مشابهة في بنيتها للأسس الآزوتية بجزيئة الـ DNA، ويمكن دخولها ضمن جزيئة الدنا مكان الأسس الأصلية في أثناء عملية تضاعفها، وينتج تأثيرها المطفر من الارتباط الخاطئ mispairing بين النوكليوتيدات على السلسلتين المتقابلتين في أثناء عملية تضاعف duplication جزيئة الدنا. مثال ذلك 5 برومو - يوراسيل 5-Bromouracil (BrU) وهو يشابه التيمين؛ إلا أنه يحتوي على ذرة بروم Br بدلاً من مجموعة المتيل، حيث يدخل مكان التيمين، ويتحد مع الأدنين، وكذلك الأمينوبيورين aminopurine المشابه للأدنين.

ب- عوامل مُقحِمة intercalating agents: وهي عادة جزيئات مسطحة flat تستطيع الولوج بين القواعد الآزوتية مسببة تشوهاً في جديلة الدنا مؤدية بذلك إلى أخطاء في أثناء عملية تناسخ الدنا وتضاعفه.

ج - تتفاعل عناصر مركبات كيميائية مع الـ DNA، مثل الأكسجين التفاعلي (النشيط) reactive oxygen، حيث يستطيع أن يغير الأسس الآزوتية مباشرة، أو أن يغير المجموعات المشفِّرة؛ مما يؤدي إلى ارتباط غير صحيح بين النوكليوتيدات على سلسلتي strands جزيئة الدنا.

د - عوامل ألكيلية alkylating agents تغير بنية الأسس الآزوتية وخصائص اتحادها مع الأسس على السلسلة المقابلة، مثل حمض النتروز nitrous acid (يسبب استبدال النوكليوتيدات)، أو مركّبات الإتيل ethyl ومتيل ميتان سلفونات methyl methanesulfonate ونتروزوغوانيدين nitrosoguanidine التي تتفـاعل مع الأسس الآزوتيـة، وتضيف إليها مجموعة متيل أو إتيل. تتباين المجموعات الألكيلية كثيراً في حجومها وبالآليات التي تستخدمها لإنتاج الطفرات.

أنواع التطفير وطرائق الكشف عن الطفرات

1- التطفير العشوائي random mutagenesis:  وهي المقاربة الأولى بالتطفير، والتي كانت تعتمد على طرائق عشوائية في إنتاج الطفرات، حيث تُعرَّض الخلية للأشعة فوق البنفسجية أو لمواد كيميائية مُطفّرة، ومن بعدها يُجرى البحث والانتخاب للصفة الطافرة المرغوبة. مثلاً يمكن أن تعرض بكتريا الإشريكية القولونية Escherichia coli للأشعة فوق البنفسجية، ومن ثم تزرع على وسط غذائي من الآغار. ثم أخذ المستعمرات البكترية التي نمت وإعادة زراعتها في وسطين: الأول غني بالعناصر الغذائية، والثاني يحتوي على الحد الأدنى فقط من العناصر الغذائية، وتُقارن المستعمرات في الوسطين، فالمستعمرات التي لم تستطع النمو في الوسط الفقير بالعناصر الغذائية هي المستعمرات التي تحتاج إلى متطلبات معيّنة كي تنمو، وهي التي توصف بأنها مستعمرات طافرة غير قادرة على النمو في الوسط الفقير(طفرة بعامل نمائي (auxotrophic mutation، ومن ثم تُعزل، وتنقَّى، وتحفظ كسلالة طافرة لحين الاستخدام. وقد جرى فيما بعد تطوير عدد من طرائق التطفير العشوائي، كاستخدام
ن- إتيل - ن- نِتروزويوريا (ENU) N-Ethyl-N-nitrosourea في الدراسات الحيوانية لإنتاج فئران طافرة، كما استخدم المركّب إتيل ميتان سلفونات Ethyl Methane Sulfonate (EMS) بكثرة في النباتات والحيوانات على حد سواء للحصول على أفراد طافرة.

2- التطفير الموجه لموقع معيّن site-directed mutagenesis: وجد الباحثون أن من المفضل إدخال التغيرات النوعية على جزيئة الدنا مباشرة، لذلك استخدمت في البداية مشابهات للنوكليوتيدات ومركّبات كيميائية أخرى بهدف إحداث طفرات موضعية. ومن هذه المركّبات الأمينوبورين aminopurine الذي يحرض تَحوُّل AT إلى CG، في حين يمكن لمركّبات النتروزوغوانيدين وثنائي السلفيت bisulfite وN4 هدروكسي سيتيدين N4-hydroxycytidine أن تُحرّض تَحوُّل الـ CG إلى AT. وتسمح هذه الطريقة بإحداث طفرات نوعية خاصة ببروتين محدد، ومع ذلك فإن هذه الطريقة ليست مرنة بالقدر الكافي على مسـتوى نـوع الطافرات mutants التي تنتجها، وليست متخصصة بالدرجة التي تميزت بها فيما بعد وسائل أخرى من التطفير الموجَّه لموقع معيّن.

تتضمن الطرائق الحالية المتخصّصة بموقع معيّن إحداث التطفير باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات oligonucleotides بتفاعل يهدف إلى إطالة البادئة باستخدام إنزيم الـدنا بوليمراز DNA polymerase، حيث تسمح هذه الطرائق بإحداث طفرات نقطية سواء بإدخال insertion قطع صغيرة من الـدنا إلى مواقع محددة أم حذفها deletion.

يمكن أن تتم مقاربة التطفير الموجه لموقع محدّد بالغربلة للبحث عن طفرات الآلانين مثلاً، حيث يجري تطفير النوكليوتيدات إلى آلانين بهدف التعرف إلى النوكليوتيد المهم لبنية بروتين معيّن أو لوظيفته أو توليفه.

3- التطفير التوافقي combinatorial mutagenesis: هو تقنية تسمح بغربلة (تحري) screening عدد كبير من الكائنات الطافرة لصفة معيّنة. يجري بهذه التقنية تغيير عدد قليل من المواقع المختارة أو تغيير شامل لقطعة صغيرة من الـدنا للحصول على مكتبة من البروتينات الطافرة. تتمثل إحدى المقاربات بهذه التقنية بقص جزء من الـدنا، ويُستبدل به مقطع مأخوذ من مكتبة المقاطع النوكليوتيدية التي تحتوي على جميع التوليفات combinations الممكنة على مواقع الطفرات المرغوبة. مع ذلك يمكن أيضاً أن تدخل قطعة عشوائياً ضمن الجين فتعطل عملها بهدف تقييم الأهمية البنيوية أو الوظيفية لجزء محدد من البروتين.

4- التطفير الإقحامي insertional mutagenesis: تقنية تستخدم قطع متحركة من الـدنا (الينقول transposon)، أو الفيروسات القهقرية retrovirus، مثل فيروس ورم الثدي عند الفئران mouse mammary tumor virus، وفيروس ابيضاض الدم الفأري murine leukemia virus، حيث يمكن استخدامهما لتحديد الجينات المعنية بعملية حدوث السرطانات ولفهم الآلية (الطرائق) البيولوجية لأنواع معيّنة من السرطانات. يمكن استخدام هذا النوع من التطفير أيضاً بدراسة الوظيفة الخاصة بجين محدد.

5- التأشيب المماثل homologous recombination: يمكن استخدام هذه الطريقة لإنتاج طفرات نوعية متخصصة بعضو أو كائن محدد، حيث يجري إدخال ناقل vector- يحتوي على تسلسل نوكليوتيدي مشابه للجين المراد تعديله- إلى الخلية، ويجري من خلال عملية التأشيب استبدال جين جديد بالجين الهدف.

طرائق الكشف عن الطفرات mutation detection methods: تتباين طرائق الكشف عن الطفرات وفقاً لنوع الطفرة التي يُبْحث عنها فيما إذا كانت طفرات مجينية أو صبغية أو جينية (نقطية)، وتعتمد طرائق الكشف عن الطفرات على طريقتين أساسيتين هما الكشف الخلوي cytogenetic أو الكشف الجزيئي molecular، أو على الاثنين معاً: الكشف الخلوي الجزيئي.

أ - الكشف عن الطفرات المجينية والصبغية:

يجري الكشف عن هذه الطفرات بالطرائق الآتية:

- الفحص المجهري للخلايا cytogenetic test: حيث تُجهّز المحضّرات على أن تكون الخلايا في مرحلة الانقسام وفي الطور الاستوائي metaphase الذي يكون فيه الصبغي بشكله المميز والواضح، ويجري عد الصبغيات، وهي مناسبة للطفرات المجينية التي تخصّ عدد الصبغيات.

- التباين بامتصاص الأشعة في أثناء الفحص المجهري بين محضرات خلايا قبل التضاعف (2ن) ن وبعد التضاعف (4 ن): بالاعتماد على خاصية الـدنا أو بعض الصبغيات بالامتصاص النوعي للأشعة.

- دراسة النمط النووي karyotype، وهي تسمح بالكشف عن التغيرات التي طرأت على بنية الصبغي أوعدد الصبغيات من خلال مقارنة الصبغيات في خلايا غير مطفّرة مع الصبغيات في خلايا مطفّرة.

ب - الكشف عن الطفرة الجينية: ثمة عدة طرائق للكشـف عن الطفـرات الجينية، وأكثـرها استخدامـاً في الوقت الحالي الطـرائق المعتمدة على التحاليل الجزيئية. وعلى العموم يجري كشف الطفرات التي تحصل على مستوى نوكليوتيد واحد من خلال تحليل التتالي النوكليوتيدي sequencing أو الهضم الإنزيمي و/ أو التهجين الجزيئي، ومن تلك الطرائق:

- تألق التهجين في الموقع Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): تسمح هذه الطريقة بالتحديد الدقيق لموقع جينات معيّنة على الصبغي، كما تسمح بتمييز حالات التضاعف الصبغي، وهي تعتمد على إضافة مسابر موسومة إلى محضَّرات تحوي الصبغيات بالطور الاستوائي، وتقوم بالبحث عن التسلسلات المتممة لها على الصبغيات والتهجين معها.

- التهجين المجيني المقارن Comparative Genomic Hybridization (CGH): وهي تقنية تطبق لكشف حالات عدم التوازن المجيني. تعتمد هذه التقنية على مقارنة كامل الـدنا المجيني لكائن مطفّر مع الـدنا المجيني لكائن طبيعي. يوسم دنا المجينين بمادتين متوهجتين مختلفتين ويضافان إلى دنا مجين طبيعي مثبت على شريحة، ويُتركان للتهجين، ومن ثم تُفحص نتائج التهجين باستخدام مجهر يتعرف المادة المتوهجة، وبوجود كاميرا؛ تُلتقط صور لنتائج التهجين، وتحلل لمعرفة التغيرات التي طرأت على عدد نسخ جزيئات الـدنا نتيجة الطفرات من زيادة أو فقد.

- الكشف عن طفرة معروفة: تستخدم حالياً تقنيات تعتمد على التفاعل التسلسلي للبوليمراز Polymerase Chain Reaction (PCR)، مثل:

• النسخ العكسي بالتفاعل التسلسلي للبوليمراز Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR): تسمح بدراسة الطفرات على مستوى الـرنا.

• التفاعل التسلسلي للبوليمراز متعدد البادئات multiplex PCR: تسمح بالكشف عن عدة طفرات في الوقت نفسه، ويستخدم عدة أزواج من البادئات بوقت واحد.

• التفاعل التسلسلي للبوليمراز المتداخل nested PCR: الذي يتضمن تفاعلين متداخلين للبوليمراز، حيث تستخدم نواتج التفاعل الأول كقالب للتفاعل الثاني.

• تفاعل تضخيم أليل نوعي Allele-Specific Amplification (AS-PCR) or ARMS-PCR: تسمح بكشف طفرة موضعية أو طفرة نتيجة حذف لتسلسل نوكليوتيدي صغير.

• التفاعل التسلسلي للبوليمراز بالزمن الحقيقي real time PCR: يستخدم لدراسة تأثير الطفرة في تعبير الجينات ويتم الكشف عن تفاعل التضخيم بالزمن الحقيقي.

• مصفوفة الـدنا DNA microarray: وهي طريقة تسمح بالكشف عن عدة طفرات بوقت واحد، حيث يثبت مقطع دنا وحيد السلسلة أو عدة مقاطع على شريحة بطريقة مصفوفة، ومن ثم تستخدم العينة المراد دراستها من الـدنا بعد وسمها بمادة متوهجة، وتُترك لتتهجن مع التسلسل المكمل لها على الشريحة.

• تحليل التتـالي النوكليوتيدي أو السلسـلة DNA sequencing وهي أكثر الطرائق دقة، حيث يجري التعرف إلى التركيب النوكليوتيدي الدقيق للجين العادي والجين الطافر ومقارنتهما؛ ليُسْتدل على مكان الطفرة ونوعها.

• طريقة تضخيم المسبر المعتمد على الربط المتعدد Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) : تستخدم للبحث عن طفرات النقص والتكرار عند عدد قد يصل إلى خمسين مجين دنا أو رنا.

  وفي حال كانت الطفرة غير معروفة، فيمكن كشفها باستخدام:

• تقنية التعدد الشكلي لأطوال الشدف المقتطعة Restriction Fragment Lengths Polymorphism (RFLP): التي تسمح بكشف طفرة على مستوى نوكليوتيد واحد، حيث تُفضي إلى تغيير في موقع إنزيم القطع، فلا يستطيع الإنزيم التعرف إلى التسلسل النوكليوتيدي وقطعه كالسابق؛ مما يؤدي إلى الحصول على شدف دنا متباينة بأطوالها ما بين الأفراد المطفّرة وغير المطفّرة.

• تقنية التعدد الشكلي بهيئة السلسلة المفردة Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP): هي طريقة مناسبة للطفرات التي تتمثل بحالات استبدال نوكليوتيد بآخـر، أو فقد تسلسـلات دنا صغيرة أو إضـافتها، حيث تؤدي التغيرات التي تصيب الـدنا إلى تغيير شكل هجرة الجزيئات الطافرة أحادية السلسلة في أثناء عملية الرحلان الكهربائي مقارنة بالجزيئات الطبيعية.

• تقنية تدرّج التمسيخ على هلام الرحلان الكهربائي Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE): هي طريقة يمكن من خلالها الكشف عن الشدف المضخمة ذات الطول المتماثل لكنها تملك تسلسلًا مختلفًا نتيجة حدوث الطفرات بسبب سلوك التمسيخ المختلف لها في أثناء الرحلان الكهربائي على الهلام الذي يحتوي على تدرج من المواد الممسخة.

• تقنية التحليل المُضاعِف المتغاير heteroduplex analysis: حيث يُمزج دنا من الفرد الطبيعي مع دنا الفرد الطافر، ويُعرَّضان معاً لشروط تُحَولهما إلى مفردي السلاسل، ويتركان كي يعادا ثانية إلى حالة السلاسل المزدوجة، فيحصل 3 أنواع من السلاسل المعاد ارتباطها: النوع الأول ممثل للفرد الطبيعي، والثاني ممثل للفرد الطافر، والثالث جزيء هجين مكون من سلسلة من الفرد الطبيعي وسلسلة من الفرد الطافر، وتختلف هذه السلاسل الثلاث بعضها عن بعض بطريقة هجرتها في أثناء الرحلان الكهربائي.

  مراجع للاستزادة: - A. Catala, M. Fasullo, Mutagenesis and Mitochondrial-Associated Pathologies, Intechopen, 2022. - N. Gupta, Carcinogenesis and Mutagenesis, ‎ LAP LAMBERT Academic Publishing, 2016. - S. M. Pruett-Miller, Chromosomal Mutagenesis (Methods in Molecular Biology, 1239), Humana 2014. - S. Umavathi et al., PLANT MUTAGENESIS: Induced Mutation for Crop Improvement, ‎ LAP LAMBERT Academic Publishing, 2020.

---

- التصنيف : الوراثة والتقانات الحيوية - النوع : الوراثة والتقانات الحيوية - المجلد : المجلد الثامن مشاركة :