تفاعل البوليمراز المتسلسل
تفاعل بوليمراز متسلسل
Polymerase Chain Reaction (PCR) -
سمير أبو إصبع
مكونات تفاعل البوليمراز المتسلسل
آلية عمل جهاز تفاعل البوليمراز المتسلسل
كفاية تفاعل البوليمراز المتسلسل
أنواع أجهزة تفاعل البوليمراز المتسلسل
تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل أو أهدافه
تُحفظ المعلومات الوراثية في الكائن الحي داخل الحمض النووي الريبي المنقوص الأكسجين Deoxyribonucleic Acid (الدنا DNA). وتقوم الخلية بمضاعفة كميته وقت انقسامها على نحو تلقائي وسريع مع وجود نظام تصحيح للأخطاء. ومع التطور السريع في كثير من التقانات الحيوية - الذي يعتمد على التعامل مع الدنا على نحو أساسي - اهتم العلماء بالبحث عن طريقة أو تقنية تحقق مضاعفة كمية الدنا في المختبر على نحو كبير وسريع ودقيق، فكانت عدة محاولات لتحفيز الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو growth factors؛ لكن ذلك لم يكن ذا جدوى لأسباب كثيرة.
ابتكر العالم الأمريكي كاري ب موليس Kary B. Mulissفي عام 1983 تقانة تفاعل البوليمراز المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR). وتقديراً لدوره في هذا الاختراع حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993. وتعد تقنية تفاعل البوليمراز المتسلسل أساسية في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية وبوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التقانات الحيوية. وكان من أهم الأسباب التي ساعدت على انتشارها عدم اعتمادها على النظام الحيوي (أي الخلية) والتحكم بكمية الدنا والسرعة في الإنتاج؛ لكن من أهم عيوبها كان عدم وجود نظام إصلاح عند حدوث أي ارتباط خاطئ mismatching .
وتُستخدم هذه التقنية لتضخيم amplification قطع الدنا أو إكثارها؛ وأحياناً قطع الرنا RNA المراد دراستها خارج النظام الحيوي بدقة وبسرعة، ولهذا سُمّيت هذه الطريقة بناسخة الدناDNA photocopier. وتُمكّن من الحصول على كميات كبيرة من الدنا المطلوبة لإجراء تجارب أو مقارنات متنوعة في البيولوجيا الجزيئية، ويُنسب إليها الجهاز الذي تجري فيه، وهو الـ PCR (الشكل 1).
 |
|
| أ- جهاز PCR شكل عام. | ب- أجزاء جهاز .PCR |
|
الشكل (1). |
|
مكونات تفاعل البوليمراز المتسلسل
يجري تفاعل البوليمراز المتسلسل (PCR) ضمن أنبوب اختبار بوجود المكونات الآتية والموضحة في الشكل (2).
1.النوكليوتيدات منقوصة الأكسجين ثلاثية الفسفاتDeoxynucleotide Tri Phosphate (DNTPs) وتُعدّ أحجار الأساس في التفاعل ومن المكونات الأساسية للـدنا، وهي الأدنين adenine (A) والتيمين thymine (T) والغوانين guanine(G) والسيتوزينcytosine (C)، حيث يرتبط الأدنين بالتيمين برابطتين هدروجينيتين، والسيتوزين بالغوانين بثلاث روابط هدروجينية. ويكون التركيز المطلوب في التفاعل من تلك النوكليوتيدات 50 -200 مكرومول (µM) لكل منها، ويمكن أن يؤدي التركيز المرتفع إلى ارتباطات غير مناسبة misincorporations لإنزيم البلمرة.
 |
|
الشكل (2) العبوات الأم المحتوية على المواد الكيميائية الداخلة في التفاعل: 1- dNTPs، 2- Taq، 3- PCR buffer، 4- Mgcl2. |
2. إنزيم بلمرة الدنا: ويُسمى اختصار Taq polymerase نسبة إلى البكتريا التي عُزل منها وتدعى Thermus aquaticus، وهي نوع من البكتريا يمكنها تحمل درجات حرارة عالية؛ ومن ثم هو إنزيم مقاوم للحرارة العالية. ويُضيف هذا الإنزيم النوكليوتيدات إلى النهاية الحرة OH-3' من المرئسة primer؛ بحيث تكمل نوكليوتيدات قالب الدنا (الشكل 3). ويعد التركيز المثالي لهذا الإنزيم هو 0.5- 2 وحدة في تفاعل الـPCR ، وحجمه50 مكرولتر µl؛ وقد يؤدي التركيز المنخفض إلى تقليل إنتاجية PCR، ويمكن أن يُنتج التركيز المرتفع نواتج غير مرغوبة.
 |
|
(الشكل 3) استطالة البادئة بوساطة إنزيم Taq. البادئة ترتبط بالتسلسل المكمل على سلسلة قالب الدنا. ثم يقوم إنزيم Taq باستخدام سلسلة القالب لتطويل البادئة بوساطة DNTP الصحيح إلى الأساس المقابل. |
3. المرئسات (البادئات): وهي تسلسلات قصيرة من الـDNA يُراوح طولها من 10-24 نوكليوتيداً تقريباً أحاديّة السلسلة متممة لتسلسل الدنا الهدف، تُصنّع في المختبر، وتمكّن إنزيم Taq من بدء بناء سلاسل الدنا. ويجب أن تحتوي المُرئسة - في أثناء تصميمها - على نسبة عالية من نوكليوتيدات الغوانين والسيتوزين بنسبة لا تقلّ عن 60% من مجموعها، التي تزيد من درجة حرارة ربط البادئة بقالب الدنا، ولكل مرئسة درجة حرارة ربط تختلف باختلاف محتواها من الأسس الآزوتية، والتي يمكن أن تحسب من المعادلة (1):
 |
التي تعكس فعل شفع الأسس G/C الأكثر ثباتاً واستقراراً من شفع الأسس A/T نتيجة لربطها بروابط هدروجينية أكبر، وتمثل درجة حرارة الانصهار melting temperature (Tm) درجة الحرارة التي يرتبط عندها نصف كمية المرئسة بقالب الدنا في المنطقة المرغوبة.
4. شاردة 
: وهي تعمل بارتباطها بإنزيم Taq على تحفيزه، وتُسهم أيضاً في ثبات سلسلة الدنا المضاعفة. ويُقلل التركيز المنخفض لشوارد المغنزيوم من إنتاجية PCR، في حين يعطي التركيز المرتفع منه تضاعفاً (تضخيماً) غير نوعي non-specific amplification، ويُعدّ التركيز 1.5 ميلي مول التركيز المثالي في معظم الحالات؛ لكن التركيز الذي يمكن أن يزيد في كفاية التفاعل على نحو حركي في بعض الحالات يراوح بين 0.5- 10 ميلي مول (mM).
5. قالب الدنا template : شدفة من الـ DNA المراد تضخيمها ودراستها تختلف كمية الدنا التي تدخل في تفاعل الــــــ PCR، باختلاف التقنية المستخدمة وبحسب جودة الدنا المُستخلص، ويبدو الدنا الجيد- بعد ترحيله على هلامة الآغاروز في جهاز الرحلان الكهربائي - على شكل حزمة متكاملة واضحة وشديدة اللمعان في حين يشكل الدنا غير الجيد لطاخة smear، وهذا يعني أن الدنا محطّم إلى قطع مختلفة الحجوم منتشرة على طول الهلامة، وتكون كمية الدنا الداخلة في التفاعل عموماً نحو 100 بيكوغرام (pg) من دنا البلازميد أو100- 50 مكروغرام (µg) من الدنا الجينومي، فالكمية الكبيرة من الدنا (أو أي مواد مرافقة أخرى) قد تكون عوامل مثبطة، في حين قد تعطي الكمية المنخفضة نتيجة مرضية، وذلك ضمن ظروف مناسبة وعدد كافٍ من الدورات.
آلية عمل جهاز تفاعل البوليمراز المتسلسل
لإنجاز تفاعل البوليمراز المتسلسل النموذجي بحجم 20-50 مكرولتر؛ تُمزج المكونات الخمسة المذكورة أعلاه في أنبوب اختبار صغير (0.2 مل) متحمّل للحرارة يحوي محلولاً موقياً (واقٍ) buffer، ثم يُغلق الأنبوب بإحكام، ويوضع داخل جهاز الـــــ PCR، ولهذا الجهاز قاعدة من الألمنيوم مزوّدة بحفر مناسبة؛ لتوضع فيها الأنابيب، ويمكن لهذه القاعدة أن تُبرّد وتُسخَّن إلى درجة حرارة معيّنة ولأزمنة معيّنة، بسرعة كبيرة وبدقة عالية، والجهاز مُبرمج ذاتياً للقيام بذلك.
وتمر عملية التضخيم بثلاث خطوات رئيسة لكل منها درجة حرارة مختلفة عن الأخرى (الشكل 4)، وتشكل مع بعضها دورة cycle، ثم يقوم الجهاز بتكرار تدويرها على نحو متتالٍ لأكثر من 25-40 دورة، ولذلك يسمى جهاز الـــــ PCR المِدوار الحراري thermal cycler.
 |
| الشكل (4) الخطوات الثلاث المشكلة لدوران PCR. |
وفيما يأتي توضيح لخطوات العمل:
1- فك التشافع denaturation: ترفع درجة حرارة مزيج الـــ PCR إلى 94ْ س مدة تراوح بين 1- 5 دقائق، فتتحطم الروابط الهدروجينية بين الأسس الآزوتية في الجديلتين المتقابلتين من شريط الدنا المضاعف، وتعطي جديلتين مفردتين.
2- ارتباط المرئسات annealing: يُبرد مزيج الــــــ PCR إلى درجة حرارة بين 30-65ْ س ومدة دقيقة واحدة؛ لتتمكن المرئسات من الارتباط بمتمماتها من جدائل قوالب الدنا المفردة، وتختلف درجة الحرارة هذه بحسب طول المرئسة ومكوناتها من القواعد الآزوتية.
3- الاستطالة extension: يُسخن التفاعل ثانية إلى الدرجة 72ْ س مدة 1.30 - 2 دقيقة، وهي درجة الحرارة المناسبة لإنزيم Taq؛ ليقوم ببناء (مضاعفة) جديلة متممة لجديلة الدنا القالب المفردة ابتداءً من المرئسة.
ومنعاً لتبخر محتويات الأنابيب - نتيجة تعرضها للحرارة المرتفعة في أثناء سير التفاعل - يُزوَّد جهاز الـــ PCR بغطاء معدني ساخن يُحكِم إغلاق جميع الأنابيب معاً، وتصل درجة حرارته إلى 106ْ س، وفي الأجيال الأولى من أجهزة الـــ PCR - غير المحتوية على هذا الغطاء الساخن- كان يُضاف إلى أنابيب التفاعل زيت معدني للغاية ذاتها.
يزداد تعداد نسخ قطع الدنا تزايداً أُسِّياً ملحوظاً وعلى نحو كبير في الدورات 20-30 الأولى، ولا يلبث أن يبدأ بالانخفاض حتى الوصول إلى مرحلة الثبات أو الاستقرار (الشكل 5)، ويُعزى ذلك إلى تراكم نواتج الـــ PCR بنحو0.3-1 بيكومول.
 |
| الشكل (5) التزايد الأسي لعدد قطع الدنا في الدورات: 20-30 الأولى، وبعدها يبدأ الانخفاض للوصول إلى مرحلة الثبات أو الاستقرار. |
ويجب أن يكون عدد الدورات بالحد الأدنى المطلوب؛ لأنه بعد الوصول إلى الطور الثابت تحدث زيادة في عدد التضاعفات غير النوعية، كما أن عدد الدورات المطلوبة يعتمد - في جزء منه - على جودة قالب دنا العينة.
ولا يكفي – غالباً - فصل جديلتي الدنا، ومن ثم فإن تفاعل الــ PCR يخفق، لذلك تُضاف خطوة ابتدائية من فك التشافع تسبق خطوة فك التشافع الداخلة في دورات الـــ PCR، وتتمثل بالدرجة 95 ْس مدة دقيقة واحدة، وخاصة إن كان دنا القالب غنيّاً بالـروابط G-C.
وبالمقابل يفقد إنزيم Taq نشاطه عند درجات الحرارة المرتفعة، حيث يبلغ نصف عمره نحو 40 دقيقة عند درجة الحرارة 95 ْس؛ ونحو 5 دقائق عند درجة الحرارة 98 ْس ، لذلك يجب أن يكون زمن خطوة فك التشافع ومقدار درجة الحرارة ضمن الحدود الدنيا. ويعتمد تقدير درجة الحرارة في خطوة الربط على المرئسة من حيث طولها ونوعية الأسس الآزوتية المكوّنة لها.
ويُراوح معدل صنع إنزيم Taq للنوكليوتيدات المكملة بين 35-100 نوكليوتيد/ثانية، ويعتمد ذلك على مكونات محلول الــــ PCRالموقي وجودة قالب الدنا ونقاوته. ولا بد بعد انتهاء دورات الــــ PCR من مساهمة خطوة إضافية لمرحلة الاستطالة، وذلك مدة 5-10 دقائق، وغالباً ما تكون ضرورية للتأكد من أن جميع القوالب المرتبطة بالمرئسات قد تمت مضاعفتها على نحو كامل.
كفاءة تفاعل البوليمراز المتسلسل
يتضاعف عدد جزيئات DNA نظرياً في كل دورة من PCR على نحو أُسّي، حيث يمكن حسابه من المعادلة (2):
| (2) كمية إنتاجية الـــ PCR = كمية DNA الداخل في التفاعل × (1 + الكفاءة%)عدد الدورات |
|
فمثلاً: في 26 دورة من الــــ PCR وبوجود 1 بيكوغرام من DNA وبكفاءة 70%، ينتج نحو 1 مكروغرام المعادلة (3): (3) كمية إنتاجية الــ PCR= 1بيكوغرام × (1+0.7)26 =981007 بيكوغرام = 0.98 مكروغرام =1 مكروغرام. حيث: 1غ = 10-3 مكروغرام = 10-6 نانوغرام = 10-9 بيكوغرام. |
كما أنه هناك بعض المشاكل التي تقلل من هذه الكمية مثل عدم نشاط إنزيم Taq وضعف ارتباط المرئسة لقالب الدنا وعدم الانفصال الكامل لسلسلة الدنا المضاعفة.
أنواع أجهزة تفاعل البوليمراز المتسلسل
يعمل جهاز الزمن الحقيقي (RT-PCR) Real Time PCR، والذي يسمى أيضاً بجهاز الزمن الحقيقي الكمي (QRT-PCR) Quantitative Real Time PCR وفقاً لمبدأ جهاز الـــ PCR العادي نفسه؛ لكنه موصول بالحاسوب لتحديد الوقت الحقيقي لبدء التفاعل داخل كل أنبوب، ومن ثم معرفة فيما إذا كان تسلسل الدنا المطلوب موجوداً في العينة أو لا، ومعرفة عدد نُسخه فيها، وذلك قبل الوصول إلى الدورات الأخيرة؛ كما يقوم بحساب كمية الدنا الناتج في كل دورة، ومن هنا أتت التسمية (الزمن الحقيقي).
وهناك طريقتان شائعتان في حساب كمية الدنا في التفاعل؛ الأولى باستخدام الأصباغ المتألقة dyes fluorescent التي تتداخل مع الدنا مضاعف السلسلة، والثانية هي المسابر probes التي تعطي التألق عندما ترتبط بمتمماتها من الدنا.
تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل أو أهدافه
لتقنية PCR أهداف ومجال واسع من التطبيقات، منها: تحديد البصمة الوراثية genetic fingerprint، حيث ساهمت في فحص الشواهد الحيوية في الحالات الجنائية والطب الشرعي forensic medicine، وذلك بتحديد هوية الجاني على أرض الجريمة مثلاً. وكذلك اختبار الأبوة paternity والكشف عن الفاعل في حالات الاغتصاب raping والتعرف إلى الجثث المشبوهة وتتبع الأطفال المفقودين، كما كان لهذه التقنية الكلمة الفصل في قضايا الأنساب، وكشف تلوث الأغذية بالأحياء الدقيقة وتحديده، وتشخيص الأمراض الوراثية؛ وذلك بالكشف عن الطفرات الجينية، وكذلك المساهمة في رسم الخريطة الجينية genetic map، وتحديد درجة القرابة الوراثية بين الأنواع. ويمكن تنفيذ هذه التطبيقات
باستخدام الواسمات الجزيئية PCR-based molecular markers، وتقنيات التضخيم العشوائي متعدد الأشكالRandom Amplified Polymorphic DNA (RAPD) أو تعدد أطوال الشدف المضخمة Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) أو تكرار التسلسل البسيط Simple Sequence Repeat (SSR) ، والتي تختلف عن بعضها بالمرئسات من حيث التسلسل والطول وأماكن ارتباطها بقالب الدنا؛ ومن ثم القطع المراد دراستها والغاية المرجوة منها.
|
مراجع للاستزادة: - M. A. Behlke, K. B. Jäger, Polymerase Chain Reaction: Theory and Technology, United Kingdom, Caister Academic Press, 2019. - S. Maddocks, R. Jenkins, Understanding PCR: A Practical Bench-Top Guide. Netherlands, Elsevier Science, 2016. - E. van Pelt-Verkuil, et al. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification, Netherlands, Springer Netherlands, 2008. |
- التصنيف : علم الحياة (البيولوجيا) - النوع : علم الحياة (البيولوجيا) - المجلد : المجلد التاسع مشاركة :
اخترنا لكم
المجلدات الصادرة عن موسوعة العلوم والتقانات
