بروتينات (تنقيه)

Protine purification -

البروتينات (تنقية-)

عمار محمود إبراهيم

تنقية البروتينات استناداً إلى خصائصها  

طرائق تنقية البروتينات 

بروتوكولات التنقية 

تنقية البروتين protein purification هي سلسلة العمليات الرامية إلى عزل بروتين ٍ واحدٍ من خليط حيوي معقد من أجل تحديد خصائصه ووظيفته وتفاعلاته وبنيته لأغراض إما تحضيرية تنتج كميات كبيرة نسبياً من البروتين لاستخدامات لاحقة، كإنتاج مستحضرات تجارية من إنزيم ما (مثل اللاكتاز)، أو بروتين مغذٍ (مثل بروتين فول الصويا)، أو مستحضرات صيدلانية حيوية (مثل الإنسولين)؛ وإما تحليلية مختلفة كيفية أو كمية، كما هي الحال في تنقية بروتيني الببسين واليورياز.

وعلى الرغم من أن تاريخ تنقية البروتين يعود إلى نحو قرن من الزمن مازال المتخصصون يكتشفون المزيد من تقنياته الحديثة. ويُعد علم تنقية البروتينات من أسرع العلوم نمواً وأكثرها بحثاً لأهميته في المجالات العلاجية خاصة ولتطبيقاته المتعددة في المجالات البحثية كافة. وتعود أهميته إلى حاجة غالبية المستحضرات الصيدلانية الحديثة المحضرة باستخدام التقانات الحيوية المختلفة- في مرحلة من مراحل تحضيرها- إلى تطبيق تقانات تنقية البروتينات، كما أن دراسة أي بروتين تتطلب بادئ ذي بدء تنقيته بدرجة مقبولة تسمح بتحديد هويته ودراسة خصائصه.

تتجه الأبحاث الحديثة في مجال تنقية البروتينات إلى تطوير جيل جديد من أنظمة التنقية الآلية. ويتطلب التحدي الكبير الذي تواجهه عملية تنقية البروتينات الأخذ في الحسبان مزيج الجزئيات الموجودة في المستخلص الخلوي؛ إذ توجد- إضافة إلى آلاف البروتينات التي تختلف بخصائصها بعضها عن بعض- حموض أمينية وعديدات سكريد وببتيدات وجزيئات صغيرة. كما أن تنقية الإنزيمات تتطلب معرفةً إضافيةً بحالة الإنزيم لأنه يمكن أن يوجد بحالات وأماكن مختلفة، منحلاً أو غير منحل، مرتبطاً بالغشاء الخلوي أو بالدنا، ضمن السيتوبلاسما أو في النواة.

وتتمثل بنية البروتين عادة بأربع بُنىً (الشكل 1):

الشكل (1) بنية البروتين

- بنية ٌأوليّةٌ: هي تجمعٌ لثمالاتٍ من الحموض الأمينية.

- بنيةٌ ثانويّةٌ: تلتف سلاسل ثمالات الحموض الأمينية إما بشكل حلزوني α-helix وإما بشكل صفائح متثنيّة β-pleated sheets.

- بنيةٌ ثالثيّةٌ: ترتبط مجموعة سلاسل من عديدات الببتيد مشكلة تحت وحدات.

- بنيةٌ رابعيّةٌ: هي تجمعٌ لعددٍ من تحت الوحدات لتشكل بروتيناً.

كما تؤثر في البروتينات مجموعة من الروابط أو القوى، أهمها:

• الروابط الهدروجينية: تحدث بين ذرتين؛ إحداهما ذرة هدروجين والأخرى ذرة سالبة الشحنة. علماً أن هذه الروابط تكون أقوى في درجات الحرارة المنخفضة وتضعف بارتفاع درجة الحرارة.
• التفاعلات الكارهة للماء: لايمكن للثمالات غير القطبية (إيزولوسين- لوسين- فالين- فينيل ألانين- تربتوفان) أن تشكل روابط هدروجينية محبة للماء. ولكي تتجنب الماء تميل إلى التجمع بعضها مع بعض بما يسمى التفاعلات الكارهة للماء، وهذا ما يؤدي إلى وجودها داخل البروتينات. وتزداد قوة هذه التفاعلات بازدياد درجات الحرارة وزيادة تراكيز الأملاح.
• التفاعلات الشارديّة (الإيونية): وهي تحدث بين الجزيئات ذات الشحنات المتعاكسة، وتتعلق قوة هذه الجزيئات بالمسافة الفاصلة بين الجزيئات وبثابت العزل الكهربائي للمحل الذي توجد فيه، وبدرجة الحموضة التي تحدد عدد الثمالات المشحونة. وتضعف هذه الروابط بزيادة القوة الشاردية للمحلول حيث تحيط بالجزيئات جزيئاتٌ معاكسة لها بالشحنة.

  تنقية البروتينات استناداً إلى خصائصها

  تختلف مبادئ التنقية فيما بينها نتيجة اختلاف البروتينات بتوزع الحموض الأمينية المشكلة لها وعددها وتتاليها؛ إذ إن ارتباط هذه الحموض بهيكل عديد الببتيد قد يجعله ذا شحنة موجبة أو سالبة، قطبياً أو لاقطبياً، محباً للماء أو كارهاً له، ويجعله ينطوي بشكل محدد في بنية ثانوية، حلزونية أو صفيحية متثنية، وبنية ثالثية ذات حجم وشكل وتوزعٍ مختلفٍ لهذه الثمالات على سطح البروتين. ويمكن وفقاً لاختلاف خصائص البروتينات وضع تسلسلٍ منطقي لعملية التنقية، لكن تعتمد كل طرائق تنقية البروتينات على واحدٍ أو أكثر من العوامل التالية:

  1- الحجم: تختلف البروتينات فيما بينها بعدد الحموض الأمينية، حيث يُراوح عددها بين بضعة حموض أمينية وعشرات الآلاف منها، وبالتالي تختلف بوزنها الجزيئي. وتتم تنقية البروتينات بتمريرها في عمود ترشيح من الهلام Size Exclusion Column (SEC) اعتماداً على حجمها. يتم ملء العمود بهلام ذي حجم مسام معين، فتعبر البروتينات ذات الحجم الأكبر على نحو أسرع لأنها لا تدخل ضمن المسام، في حين أن البروتينات ذات الحجم الصغير تدخل في شبكة المسامات، وبالتالي تستغرق وقتاً أكبر لعبورها (الشكل 2).

  الشكل(2) تنقية البروتينات بتقنية الترشيح عن طريق عمود فصل من الهلام

  2- الشكل: يختلف شكل البروتينات ما بين بروتينات ذات شكل كروي وأخرى ذات شكل غير متناظر. تؤثر أشكالها في حركتها ضمن المحلول عند تطبيق إحدى العمليات التالية: تثفيل، تمرير عبر غشاء مسامي، أو عبر هلام، أو عبر مرشحات، أو في أثناء عملية الرحلان الكهربائي. فمثلاً بروتينان لهما الكتلة نفسها ويختلفان بالشكل، أحدهما كروي والآخر عصوي، يُلاحظ عند التثفيل عبر مدروج من الغليسرول أن البروتين ذا الشكل الكروي (ذا نصف القطر الأصغر) يترسب على نحو أسرع لأنه يواجه احتكاكاً أقل، وبالتالي سيبدو وكأنه أكبر من البروتين ذي الشكل العَصَوي، في حين أنه عند استخلاصها بطريقة عمود الترشيح الهلامي بحسب الحجم فإن البروتين الكروي ذا نصف القطر الأصغر يدخل ضمن المسام ويستغرق كي يتم استخلاصه وقتاً أطول.

  3- الشحنة: يتم تحديد شحنة البروتين من خلال مجموع ثمالات الحموض الأمينية الموجبة الشحنة والسالبة الشحنة. فإذا كانت أرجحية الحموض الأمينية لـحمض أسبارتيك وحمض الغلوتاميك تكون شحنة البروتين سالبة ويتصف بصفةٍ حمضية، أما إذا كانت أرجحية الحموض الأمينية لليزين والأرجينين تكون شحنة البروتين موجبة وتتصف بصفةٍ قلويةٍ. إذاً تتحكم درجة باهاء وسطٍ ما بتوازن شحنة المجموعات المشحونة وغير المشحونة للبروتين، وبالتالي فهي تتحكم بشحنته.

  بوجه عام تُستخدَم الراتينات (الراتنجيات) resins ذات الشحنة الموجبة ضمن عواميد الفصل في مبادِلات الإيونات (الشوارد) ion exchange column لربط البروتينات ذات الشحنة السالبة، في حين تُستخدَم الراتينات ذات الشحنة السالبة لربط البروتينات ذات الشحنة الموجبة (الشكل 3).

  الشكل (4) تنقية البروتينات باستخدام تقنية الربط بربائط معينة.

   

  يتم ربط البروتين ضمن العمود بدرجة ملوحة منخفضة (M0.1 NaCl)، ويتم استخلاصه بمدروجٍ ملحيٍ متزايد التركيز حيث يحصل في مرحلةٍ معينةٍ انخفاضٌ في الجذب الشاردي بين البروتين والراتين ضمن العمود وينفصل عنه ليتم استخلاصه.

  4- نقطة التعادل الشاردي (isoelectric point (IP: هي درجة الحموضة التي تصبح فيها شحنة البروتين صفراً (عدد الشحنات الموجبة مساوٍ لعدد الشحنات السالبة)، ويتم التحكم فيها من خلال التحكم بدرجة الحموضة، كما يتم تحديدها من خلال منحني معايرة الثمالات الموجبة والسالبة ضمن البروتين. وتراوح قيمة نقطة التعادل الشاردي للبروتينات بين 4 و10.

  5- توزع الشحنة: يمكن أن تتوزع ثمالات الحموض الأمينية المشحونة على نحو منتظم على سطح البروتين أو تتكتل بشكل عناقيد إذا وضعت في وسط ذي شحنتين؛ إحداهما موجبة والأخرى سالبة، ويمكن الاستفادة من هذه الخاصة ضمن ظروف معينة في عملية تنقية البروتينات. مثلاً يمتلك بروتين الأشريكية القولونية E. coli σ32 في درجة حموضة تساوي 7.9 شحنةً سالبة قدرها 46-، وشحنة موجبة قدرها40+، مما يكسبه شحنة صافية قدرها 6-، في هذه الحالة يمكن أن يرتبط هذا البروتين بكل من المصعد والمهبط بشدة معقولة، ويعود ذلك على ما يبدو إلى أن ثمالاته المشحونة غير متوزعة بشكل متساوٍ على السطح. إن الاستفادة من هذه التقنية في تنقية هذا البروتين تأتي من أن أغلب البروتينات لن ترتبط بأي من المسريين ضمن هذه الظروف.

  6- الخاصة الكارهة للماء: توجد معظم ثمالات الحموض الأمينية الكارهة للماء داخل البروتين، لكن بعضها يوجد على سطح البروتين. يحدِّد عادة عددها ومكان توزعها على سطح البروتين، قابلية البروتين للارتباط بالأعمدة المصنوعة من مواد كارهة للماء، كما هي الحال في تفاعلات التفريق اللوني (الاستشراب اللوني) الكارهة للماء hydrophobic interaction chromatography. إذ يحقن عادة البروتين في الأعمدة الكارهة للماء ضمن تراكيز ملحية مرتفعة حيث تكون التفاعلات الكارهة للماء بأقوى حالاتها، ثم يتم استخلاصه بإمرار محلول ملحي متناقص التركيز.

  7- الانحلالية: تختلف البروتينات فيما بينها اختلافاً كبيراً من حيث قابليتها للانحلال ضمن محاليل مختلفة، حيث تتدرج من كونها عديمة الانحلال > 10 مايكروغرام/مل إلى شديدة الانحلال <300 ملغ /مل. تشمل المتغيرات الرئيسة التي تتحكم بقابلية انحلال المادة درجة الحموضة والقوة الشاردية وطبيعة الشوارد ودرجة الحرارة وقطبية المُحِلّ. وتكون البروتينات بوجه عام أقل قابلية للانحلال عند نقطة التعادل الكهربائي، حيث يتم ترسيب البروتينات عادة بشكل متدرج بإضافة تراكيز متزايدة من ملح سلفات الأمونيوم، فمثلاً تتناقص انحلالية البروتين 10 مرات بزيادة تركيز سلفات الأمونيوم نحو الإشباع بمقدار 6 %، إذ يتطلب 760 غراماً للحصول على 100 % محلولاً مشبعاً، ويُعَدّ سلفات الأمونيوم أكثر الأملاح المستخدمة لتنقية البروتينات اعتماداً على انحلاليتها لكونه معتدلاً وثابتاً للبروتينات، كما أنه منخفض السعر وعالي النقاء وشديد الانحلال.

  8- الكثافة: تراوح كثافة معظم البروتينات بين 1.3 و1.4 غ/ سم3، وبسبب هذا المجال الصغير نسبياً لا تستخدم تقنيات التنقية بناء على الكثافة استخداماً كبيراً، لكن بعض البروتينات التي تحتوي على كميات كبيرة من الفسفات (كثافة الفسفوتين= 1.8 غ/سم3 )، أو ليبيدات (كثافة بيتا ليبوبروتين= 1.03 غ/ سم3) تؤدي إلى اختلاف كبير بالكثافة؛ مما يتيح تنقيتها بتقنيات الفصل المعتمدة على الكثافة.

  9- الربط بربائط ligands: يرتبط العديد من البروتينات بركائز أو جزيئات مستقلة أو عوامل متممة أو تسلسل معين من الدنا. يمكن الاستفادة من رابط الألفة في ربط الإنزيم بعمود فصل يحوي الربائط المناسبة أو سلسلة الدنا المناسبة. مثلاً يستفرد عامل الانتساخ AP-1 بربطه بعمود فصل يحوي سلسلة معينة من الدنا (الشكل 4).

  الشكل (3) تنقية البروتينات باستخدام تقنية مبادِلات الشوارد (الإيونات)

   

  10- الربط بالشوارد المعدنية: يرتبط كثير من الإنزيمات بنوعٍ معينٍ من شوارد المعادن الممخلِبةارتباطاً جيداً بمساعدة تفاعلات تتم باستخدام السيستيئين أو الهستيدين. يمكن الاستفادة من هذه الخاصة بربط الإنزيم بمعدنٍ ممخلِبٍ مناسبٍ ضمن عمود الفصل.

  11- التعديلات التي تلي عملية النسخ: يتم تعديل البروتينات بعد عملية صنعها بإضافة مجموعات من الكربوهدرات أو الأستيل أو الفسفات أو غيرها من المجموعات التي تفيد في عملية تنقية البروتينات من خلال ارتباطها ارتباطاً وثيقاً ضمن أعمدةِ فصلٍ خاصة، فمثلاً يمكن ربط البروتينات التي تحتوي على كربوهدرات على سطحها ضمن أعمدة تحتوي على أذرعٍ من الكيتين.

  12- المشاركات القابلة للعكس: تتجمع بعض الإنزيمات ضمن ظروف معينة لتشكل مثنويات أو رباعيات أو غيرها، ويمكن فصل الإنزيمات بناء على حجم عديد الببتيد المتشكل ضمن هذه الظروف. مثلاً يشكل إنزيم بوليمراز الرنا في الإشريكية القولونية E. coli RNA polymerase بروتيناً مثنوياً في وسط من كلور الصوديوم تركيزه (0.05 M NaCl) M 0.05 ويشكل بروتيناً موحوداً monomer في وسط من كلور الصوديوم تركيزه M 0.3 (0.3 M NaCl) .

  13- تسلسل أو بنية خاصة: يمكن الاستفادة من بنية فراغية معينة لثمالة من الحموض الأمينية على سطح البروتين في عمليات تنقية البروتينات، فمثلاً يمكن الحصول على ضدٍ يميز موقعاً مستضدياً معيناً من البروتين، ويتم تحضير عمود الفصل بحيث يربط هذا الضد- الذي يرتبط بالبروتين المستهدف من جهة أخرى- بالراتنج (الاستشراب بالاعتماد على الألفة المناعية immunoaffinity chromatography التي تتميز بنقاوة عالية). ويمكن تثبيت البروتين المستهدف والاستفادة منه في ربط بروتينٍ آخر ضمن مستخلص من البروتينات، تعرف هذه الطريقة بـالاستشراب اعتماداً على الألفة للبروتينات.

  14- خصائص غير عادية لبعض البروتينات: تتميز بعض البروتينات بخصائص معينة يمكن استثمارها في عملية التنقية، مثلاً درجة الثبات تجاه الحرارة حيث تترسب أو تتجمع أو يفقد بعضها انطواءه عندما يُسخن إلى الدرجة95 °س، وبالتالي يمكن تنقية البروتين الذي يبقى فعالاً بشكله المنحل في هذه الدرجة من الحرارة. مثال آخر على الخصائص غير العادية لبعض البروتينات المقاوَمة غير العادية لإنزيم البروتياز، وهي خاصةٌ أخرى يمكن الاستفادة منها في فصل البروتين. يستفاد من هاتين الخاصتين عادة بشكلٍ مترافق، وتُعد عملية تنقية إنزيم الفُسفاتاز القلوي للإشريكية القولونية
  E. coli alkaline phosphatase مثالاً على عملية التنقية بالاعتماد على هاتين الخاصتين، حيث يتم تسخين المستخلص البروتيني ثم تنقية البروتينات المترسبة بالتثفيل، ويعالج الطافي بعد ذلك بالبروتياز الذي يهضم البروتينات الإضافية؛ ما يترك مستحضراً عالي النقاوة من الإنزيم المذكور.

  15- أذرع التنقية المصنعة بالهندسة الوراثية: أصبح بالإمكان استنساخ الدنا الحلقي (cDNA) الذي يشفر بروتيناً معيناً، وبالتالي أصبح من السهولة بمكان إنتاج سلالةٍ من الإشريكية القولولونية E. coli ذات قدرة إنتاجٍ عاليةٍ وتسخيرها في إنتاج منتَجٍ جينيٍ معينٍ. والشائع حالياً إحداث تبديلٍ في cDNA بحيث يعطي بروتيناً يحوي عدة حموضٍ أمينيةٍ إضافية في إحدى نهايتيه الآزوتية N-terminus أو الكربونية C-terminus. يمكن الاستفادة من هذه العلامة TAG كذراعٍ في عملية التنقية. أحد أشهر هذه العلامات هي إضافة 6-10 هستيدينات إلى النهاية الآزوتية (النتروجينية) للبروتين.

  طرائق تنقية البروتينات:

  يوجد الكثير من الطرائق التي تستخدم في تنقية البروتينات التي تعتمد على العوامل السابقة الذكر تصنف تصنيفاً عريضاً كما في الجدول (1).

  الجدول (1) طرائق تنقية البروتينات

  الطريقة عملية الفصل مبدأ عملية الفصل طرائق الترسيب أمونيوم سلفات ammonium sulfate الانحلالية أسيتون acetone الانحلالية بولي إيتيلينامين polyethyleneimine الشحنة، الحجم نقطة التعادل الشاردي isoelectric (حمض الكابريليك) الانحلالية، التعادل الشاردي التجزئة على مراحل phase partitioning مثلاً: استخدام البولي ايتيلنغليكول الانحلالية طرائق الاستشراب مبادلات الشوارد ion exchange (IEX) الشحنة، توزع الشحنة التفاعلات الكارهة للماء hydrophobic interaction (HIC) الخاصية الكارهة للماء الاستشراب عالي الأداء العكوس reverse-phase HPLC الخاصية الكارهة للماء،الحجم الألفة affinity موقع ربط اللجائن الألفة للدنا DNA affinity موقع ربط الدنا الألفة للّكتين lectin affinity نوع الكربوهدرات ومحتواها الألفة للمعادن الثابتة (IMAC) ربط المعادن الألفة المناعية immunoaffinity (IAC) موقع ربط مستضدي محدد الاستشراب المركّز chromatofocusing نقطة التعادل الشاردي الترشيح على هلام/ الإقصاء باستخدام الرحلان الكهربائي بالاعتماد على الحجم gel filtration/size exclusion (SEC) الحجم، الشكل طرائق الرحلان الكهربائي الرحلان الكهربائي على هلام (PAGE) الشحنة، الحجم، الشكل التركيز على نقطة التعادل الكهربائي isoelectric focusing (IEF) نقطة التعادل الشاردي التثفيل centrifugation الحجم، الشكل، الكثافة الترشيح عالي الأداء ultra filtration الحجم، الشكل

  بروتوكولات التنقية:

  تتطلب غالبية بروتوكولات التنقية أكثر من خطوةٍ واحدةٍ للحصول على درجة النقاء المطلوبة. يتم في كل خطوة منها ضياع جزءٍ من المادة، فمثلاً إذا كان المردود 80% في كل خطوةٍ فإن المردود النهائي سيكون بعد 8 خطوات 20% من المادة البدئية، لذلك من الضروري تحديد الهدف من عملية التنقية فيما يخص كلاً من النقاء والمردود والمحافظة على الفاعلية والوقت اللازم والسعة والكلفة؛ ويكون اختيار البروتوكول المناسب وما يتضمنه من خطوات تنقية مبنياً على أساس المفاضلة في تحقيق الأهداف السابقة.

  تذكر البروتوكولات التالية أمثلةً على بروتوكولات التنقية المطبقة في تنقية بعض المنتجات البروتينية:

  - تنقية الإنزيم المأشوب.

  - تنقية الجزء الرابط للضد المأشوب.

  - تنقية الأضداد وحيدة النسيلة.

  - تنقية البروتين كامل الغشاء.

  قد تتألف كل خطوةٍ من الخطوات السابقة من عدة طرائق تنقية. وعند تصميم بروتوكولٍ لعملية تنقية متعددة الخطوات يجب الأخذ في الحسبان مايلي:

  1- وجود طريقة مقايسةٍ ملائمةٍ لتتبع عملية التنقية: قبل البدء بعملية تنقية البروتينات يجب أن تتوافر طريقة تحليلٍ كيميائيٍ حيويٍ تسمح بتعرف البروتين المستهدَف ومعايرته. ويفرق عادة بين حالتين:

  - إذا كان للبروتين خواصُّ إنزيميةٌ يكشف عنها من خلال قدرة البروتين على تحويل ركيزةٍ معينةٍ إلى مادةٍ أخرى.

  - إذا لم يكن للبروتين المستهدف خواصُّ إنزيميةٌ يمكن الكشف عنها فيعاير بإحدى الطرائق الآتية:

• مناعياً.
• بقياس الكثافة.
• بقياس الامتصاص اللوني عند طول موجة الامتصاص الأعظمي، كما في البروتينات الملونة: الهيم والفلافوبروتين.
• بطرائق المعايرة اللونية: لاوري Lowry، برادفورد Bradford، بيوريت Biuret، سميث Smith، طريقة الننهدرين Ninhydrin.

  2- اختيار نسيج حيوي غني بالبروتين المستهدف.

  3- أخذ الحيطة والحذر لتقليص الضرر الذي يطرأ على البروتين أو فقدان فاعليته أو فقدان البروتين نفسه.

  4- استخدام الحد الأدنى من خطوات العمل.

  5- التخلص من المواد الزائدة بسرعة.

  6- تجنب تكرار العمليات وتجنب عمليات التحال.

  تبدأ أكثر البروتوكولات فاعليةً بخطوات فصلٍ ذات تمايزٍ منخفضٍ وسرعة كبيرة، وذلك بغية التخلص من الملوثات التي تؤثر في فاعلية البروتين بأكثر سرعةٍ ممكنة. ومن المفيد جداً أن تساهم الخطوة الأولى في تركيز البروتين المستهدف.

  يبلغ حجم السوق العالمية للأدوية البروتينية نحو 47.4 مليار دولار، ويفسر هذا مقدار الاهتمام الكبير بتقنيات تنقية البروتينات وسعي كبرى الشركات التي تنتج المستحضرات الدوائية البروتينية إلى تطوير أسرع الطرائق وأكثرها فاعليةً في الحصول على منتجٍ بروتينيٍ ذي نقاء وفاعليةٍ عاليين. وهنا يكمن التحدي بتطوير جيلٍ جديدٍ من أنظمة التنقية الآلية ذات وثوقيةٍ وسرعةٍ ومردوديةٍ عالية، وتستخدم عدة طرائق من تقنيات تنقية البروتينات مع المحافظة على فعالية المنتج البروتيني.

  مراجع للاستزادة: - R. R. Burgess and M. P. Deutscher, Guide to Protein Purification, Elsevier Inc., 2009. - S. A. Doyle, High Throughput Protein Expression and Purification: Methods and Protocols, Humana Press 2010. - C.F. Ford, I. Suominen and C.E. Glatz, Fusion Tails for the Recovery and Purification of Recombinant Proteins. Protein Expression and Purification, Elsevier Inc., 1991. - S. K. Niazi, J. L. Brown, Fundamentals of Modern Bioprocessing, CRC Press 2017.

---

- التصنيف : علم الحياة (البيولوجيا) - النوع : علم الحياة (البيولوجيا) - المجلد : المجلد الرابع مشاركة :