بروتينات (هندسه)

Protin eng -

البروتينات (هندسة-)

لمى يوسف

طرائق هندسة البروتينات

تطبيقات هندسة البروتينات

انبثقت هندسة البروتينات protein engineering من رحم التقانة الحيويّة biotechnology بوصفه اختصاصاً يهدف إلى تصميم منتجات بروتينيّة مفيدة ذات خصائص جديدة أو مرغوبة واصطناعها حيويّاً biosynthesis بما يوفّر احتياجات البشرية المتزايدة، ويستوعب استعمالاتها العلاجيّة والغذائيّة والصناعيّة المتنوّعة. يقوم هذا الاختصاص على تقنيّة الحمض النووي المأشوب recombinant DNA technology، وتعود إرهاصاته الأولى إلى أوائل الثمانينيات؛ إذ وصّف أُلمَر Ulmer عام 1983 الركائز الثلاث لهذا الاختصاص: وهي التصوير البلوري بالأشعة السينية X-ray crystallography، والتركيب الكيميائي للحمض النووي الريبي المنقوص الأكسجين chemical DNA synthesis، والنَّمذَجَة modeling الحاسوبية لبنية البروتين وتَطَوّيه folding. وشدّد أُلمَر على أهمية المشاركة بين معلومات البنية البلورية والمعلومات الكيميائيّة حول البروتين من جهة وتركيب الجينات الصُّنعية من جهة ثانية بوصفها منهجيّة قادرة على تمكين العلماء من الحصول على البروتينات المرغوبة.

طرائق هندسة البروتينات

تصنف الطرائق المعتمدة في هندسة البروتينات في ثلاث منهجيات رئيسيّة: تدعى الأولى بالتطوّر الجزيئي المُوَجَّه directed molecular evolution، فيما تعرف بالطريقة الرئيسية، وتدعى الثانية التصميم العقلاني (المنطقي) للبروتينات rational protein design. أما الطريقة الثالثة فتجمع خصائص هاتين الطريقتين، وتبني على إيجابيّاتهما.

1- التطوّر الجزيئي المُوَجَّه: يحاكي هذا النمط من هندسة البروتينات عمر الحياة ذاتها، ألا وهي عملية التطور وفق منظور دارون المعروف بالتطور الداروني Darwinian evolution. وتقوم هذه المنهجية على الإفادة من مبدأ «البقاء للأنسب»، لكن مسرح العمليات لهذا التطور ليس الأدغال أو المحيطات أو الحقول أو مزارع الماشية، بل أنابيب التجارب وبيئة مختبرات الأبحاث، والتغيرات المُحدَثَة هنا تُوجَّه على المستوى الجزيئي، وتحدث على نحو سريع يختصر آلاف السنين التي تستغرقها عملية التطور في الطبيعة لتتم في غضون أسابيع أو أشهر.

أصبحت طريقة التطور المُوَجَّه إحدى أهم الأدوات في مجال هندسة البروتينات وأكثرها فعّالية. تكتنف هذه الطريقة جولات متكرّرة من توليد تنوّع جيني/مورثي كبير في جين يرمز إلى أحد البروتينات، يلي ذلك القيام بعمليات اصطفاءٍ selection عن طريق إدخال هذه التنويعات من الجين في جراثيم تقوم بإنتاج البروتينات المُحَوَّرَة، ومن ثم إجراء اختبارات لقدرتها على القيام بوظيفة معيّنة مستهدفة، ولاحقاً إخضاع الجينات التي أنتجت أفضل البروتينات إلى جولات جديدة من التحوير لإنتاج بروتين يتفوق على البروتين «الوالدي» في الجيل السابق له. يَدَّعي بعض العلماء ومديرو بعض الشركات والمستثمرين في هذه التقانة بأنّ التطور المُوَجَّه سيمكِّنُهم من التفوّق على الطبيعة.

تشمل الطرائق الشائعةُ الاستعمالِ في توليد التنوع الجيني كُلاًّ من تفاعل البوليمراز التسلسلي Polymerase Chain Reaction (PCR) العُرضَة للخطأ (error-prone)، ومُناقلة الدنا (خلط الجينات) DNA shuffling، وإحداث الطفرات كيميائياً chemical mutagenesis، واستعمال ذريّة مُطَفِّرة mutator strain. ولتحديد هوية الطفرات المُحَسَّنة من مجموع التنوّع الجيني الذي جرى توليده؛ طُوِّرَت مصفوفة هائلة من طرائق النَّخل screening والانتقاء selection، مثل المعايرات اللونية colorimetric assays، ومعايرات النمو المعتمدة على حجم المستعمرات، والتدفق الخلوي بطريقة فرز الخلايا المُفَعَّلَة بالفلورة Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) (الشكل1-أ ).

الشكل (1): عرض بياني للاستراتيجيات الرئيسية المستعملة في هندسة البروتينات والمُؤلَّفة من (أ): التطور المُوجَّه directed evolution، (ب): التصميم المنطقي rational design، (ج): المقاربة التشاركيّة بين هاتين الاستراتيجيتين.

تُعرَف إحدى أبسط طرائق التطفير العشوائي random mutagenesis وأشيعها المستعملة في التطوّر الموجّه بـ «التطفير الإشباعي» saturation mutagenesis الذي يتضمّن استبدال حمض أميني مفرد في البروتين المستهدف بِكُلّ حمضٍ أميني من الحموض الطبيعية العشرين، ومن ثمّ الحصول على جميع التنويعات الممكنة في ذاك الموقع. أما الطريقة الأخرى للتطفير- وتعرف بـ «التطفير العشوائي النوعي المنطقة أو المُوَضَّع region-specific random or localized mutagenesis» - فهي تشاركٌ بين الطرائق المنطقية والعشوائية لهندسة البروتينات؛ بحيث تُستبدل بضع ثمالات residues من الحموض الأمينية في منطقة نوعية محددة للحصول على بروتينات ذات خصائص جديدة. الجدول (1)

الجدول (1) ملخّصٌ لمحاسن التطوّر الموجّه ومساوئه.

الحسنات المساوئ تكمن أهم محاسن هذه الطريقة في عدم تطلّبها المعرفة السابقة ببنية البروتين المستهدف أو آلية عمله لإجراء عملية تحسين خصائصه. القدرة على تطفير (إدخال طفرات) في كامل البروتين، ومن ثمّ تحديد ثمالات بعيدة عن الموقع الفعّال أو مكان ارتباط الربيطة ligand والتي يمكنها أن تؤثر في فعالية البروتين/الإنزيم بتآثرات تفارغيّة allosteric interactions. يُعَدّ الحجم الضخم للمكتبة الممثلة للطفرات المحدثة الواجب إنشاؤها أهم مساوئ التطفير العشوائي المُعتمَد في التطوّر الجزيئي الموجَّه، ويقود ذلك إلى محدوديّة في استكشاف كامل تسلسل البروتين، حتّى باستعمال أقوى طرائق النَّخل أو الانتقاء. قد يصعب -من الناحية التقنية- تطوير طرائق نخل أو انتقاء عالية الكفاءة لاختبار خاصة محددة مستهدفة للبروتين/الإنزيم. وهو متطلِّب للوقت.

2- التصميم المنطقي/العقلاني: هو عملية موجَّهة ومدفوعة معرفياً؛ إذ إنها تقوم على الإفادة من المعلومات المتراكمة سلفاً عن البروتين/الإنزيم، مثل بنيته أو تسلسله؛ بحيث يُصار إلى الاستفادة من هذه المعرفة في إحداث طفرات نوعية تستهدف حموضاً أمينية معيّنة يُعَوَّل عليها في المساهمة في تحسين البروتين؛ نظراً لامتلاكها تأثيرات بالغة الأهمية في خصائص البروتين الوظيفِيّة المُراد تحويرها، مثل التفاعل الذي يتواسطه هذا البروتين/الإنزيم (الشكل1- ب).

لعل ما يُكسِب هذه الطريقة أهميتها، ويمنحها تفضيلها بالمقارنة بطريقة التطور المُوَجَّه هو تمكينها الباحثين من الاستغناء عن القيام بالمهمة الشاقة المتمثّلة في نخل مكتبات جينية ضخمة. وعوضاً من ذلك ينطلق العلماء في هذه المقارَبة المنطقية من معرفة تسلسل الحموض الأمينية للبروتين للقيام بعمليات مقارنة منهجية لتسلسلات بروتينية متماثلة بهدف تحديد الثُّمالات التي يُحتمل أن تُغيّر فعاليته. لدى تَوفّر البنية البلورية الثلاثيّة الأبعاد للبروتين/الإنزيم المستهدَف أو البروتين/الإنزيم المُماثلة؛ فإن بالإمكان إجراء دراسة أكثر مباشرة واستفاضةً لتقصي العلاقات القائمة بين الثُّمالات الموجودة ضمن الموقع الفعّال. ووفقاً لهذه الرؤية البصرية visualization، يصبح بالإمكان إعادة تصميم بنية الموقع الفعّال في البروتين بما يسمح بحصول جملةٍ من التآثرات الكيميائيّة المعدّلة. يتجلى أحد الأمثلة على التعديلات الكثيرة التي يمكن إدخالها بتطفير ثمالة كبيرة الحجم إلى ثمالة أصغر حجماً وأكثر كُرْهاً للماء hydrophobic، ومن ثمّ توسيع الموقع الفعال، وتتيح هذه الاتِّساعية الكبرى لرُكازات substrates أضخم بالارتباط. وقد جرى تطوير العديد من الأدوات الحاسوبية لمقارنة التسلسلات المتشابهة والبيانات البنيوية لإيجاد «خريطة لقابلية تطفير» mutability map البروتينات المستهدفة.

لا يقتصر استعمال التصميم المنطقي على تعديل بروتينات/إنزيمات موجودة، بل يتعدى ذلك إلى «اصطناع» بروتينات/إنزيمات جديدة. ويتزايد نجاح الطرائق المعتمدة على إيجاد علاقات تربط بموجبها البرامج الإحصائية بين البنية والوظيفة لتصميم بروتين من جديد de novo. تتطلَّب هذه الطريقة فهماً تفصيلياً مُسهَباً لوظيفة البروتين والآلية المرغوبة لفعله الحفزي والحالات الانتقالية المصاحبة له والمركّبات الوسيطة للتفاعل (في حال كان البروتين المستهدف إنزيماً). يمكن اصطناع موقع فعّال مثالي عن طريق التَّحَكُّم في وضع المجموعات الوظيفية للبروتين في مواقع تمنح البروتين حالة انتقالية هي الدنيا من حيث حاجز الطاقة الحرّةfree energy barrier بين الركازات substrates والمُنتَج.

3- التشارك بين التصميم المنطقي والتطوّر الموجّه: شهدت السنوات القليلة المنصرمة تلاشياً للحدود والخطوط الفاصلة بين منهجيتي التطور المُوَجَّه والتصميم المنطقي، فقد غدا شائعاً قيام الباحثين بمشاركة كلتا هاتين التقانتين معاً (الشكل1- ج). ولا يوجد قالبٌ مفردٌ أو نموذجٌ واحد لهذه المشاركة، بل تتنوع الاستراتيجيات، تتمثّل إحداها بالقيام بالعمل على مرحلتين؛ يجري في المرحلة الأولى اعتماد منهجية التطور الموجّه بهدف تحديد «بقعٍ ساخنة» hotspots، ومن ثم يُصار -في المرحلة الثانية- إلى تطبيق التصميم المنطقي على هذه المناطق، أو القيام بهاتين العمليتين على نحوٍ معاكس من حيث الترتيب الزمني في حال كان الهدف تصميم بروتين من جديد. وتقوم الاستراتيجية الأخرى على الجمع بين هاتين التقانتين بإجراء ما يُعرَف بـ «التصميم نصف المَنطِقي» semi-rational design، وذلك باستهداف ثمالات نوعية للوصول إلى إشباعها بعمليات التطفير أو بتطفير قِطاع domain محدد يُشكّ في امتلاكه أهمية وظيفية. ويُنظَر إلى التصميم نصف المنطقي على أنه أداة جبارة في هندسة البروتينات؛ لأنه يُقلِّص حجم المكتبة الجينية المطلوب نخلها، ويُعظِّم نسب النجاح في التَوَصُّل إلى تحديد إصابات إيجابية.

باختصار: تعتمد هذه المكتبات الذكية على القدرة على تحديد طفرات مفيدة مفتاحية عن طريق فهم العلاقات بين البنية والوظيفة والإحاطة بالتأثيرات التي أحدثتها الطفرات في تَطَوّي البروتين وفعاليته.

ويقدّم الشكل (2) نظرة عامة على تقنيات النخل المستعملة في هندسة البروتينات.

الشكل (2): ملخص يُجْمِل تقنيات النخل screening. (أ): الخطوات التجريبية التي تبدأ بالحصول على المكتبة الجينية بوصفها منتَجات لتفاعل الـ PCR وصولاً إلى عملية النخل. الجدير ملاحظته أن كفاءة عمليتي التنسيل والتحوير محددة بحجم المكتبة، (ب): شرح الرموز المستعملة، (ج): نمو الخلايا وانتقاء القادرة منها على البقاء والنخل على أطباق الآغار، (د): نخل في أطباق معايرة حجمية دقيقة/صُغرِيَّة، (ه): الخلية بمنزلة مفاعل دقيق/صغري، (و): العرض على سطح الخلية، (ز): الخلية في قطيرة، (ح): التأطير في مقصورات.

تطبيقات هندسة البروتينات

لهندسة البروتينات مصفوفة كبيرة من التطبيقات التي وثّقَت في الأدبيات، تشمل التحفيز الحيوي biocatalysis في الأغذية والصناعة والتطبيقات البيئيّة والطبية والتقانة النانَوِيَّة.

1- التطبيقات في صناعة المنظفات والصناعات الغذائية: تستفيد الصناعات الغذائية من إنزيمات مثل الأميلاز amylases والليباز lipases في عمليات معالجة الأغذية. ويعود الفضل في ذلك إلى تقانة الدنا المأشوب وهندسة البروتينات في استحداث جملةٍ من التحسينات في خصائص هذه الإنزيمات. فقد أدى حذف الجينات الأصلية المرمّزة لإنزيمات بروتياز proteases خارج خلوية- على سبيل المثال- إلى زيادة في مردودية إنتاج الإنزيم في أنظمة التعبير المكروبية. كما نجحت الجهود لخفض إنتاج المستقلَبات السامة الثانوية لتحسين إنتاجِيَّتِها بصفتها مضيفاً لإنتاج الإنزيمات.

لهذه العائلات الكبيرة من الإنزيمات (مثل البروتيازات والليبازات والأميلازات) أهمية في الصناعات الغذائيّة وصناعة المنظفات، ويعود ذلك إلى المجال الواسع من تطبيقاتها الصناعية. مثلاً يُنسَب إلى البروتيازات تطبيقات عديدة في الصناعات الغذائية في مجال إنتاج صيغ مغذية منخفضة القدرة على توليد الأرجِيَّة لدى الرُّضَّع وفي تخثر الحليب وصناعة المُنَكِّهات. وفي الوقت ذاته، لهذه الإنزيمات أهمية كبيرة في صناعة المنظفات؛ إذ تستعمل في إزالة البقع البروتينية.

وتواجه هندسة البروتينات في نطاق تحسين البروتيازات تحديات من قبيل اصطناع بروتينات ذات فعالية عالية في باهاء قلوي alkaline pH ودرجة حرارة منخفضة أو زيادة ثباتها في درجات حرارة مرتفعة.

إن إنتاج البروتيازات المكروبية ملائم صناعياً نظراً لانخفاض التكلفة ومردودية الإنتاج العالية وسهولة المنابلة الجينية. من بين هذه البروتيازات تكتسب البروتيازات القلوية alkaline protease الجرثومية أهمية تجارية خاصة نظراً لتطبيقاتها في مجال المنظفات. ومن أهم المنتجات التجارية سابتيليزين كارلسبِرغ subtilisin carlsberg، وسابتيليزين BPN وسافيناز savinase، التي أثمر استعمالُ تقنيات هندسة البروتينات تحسيناً لكفاءتها التحفيزية وثباتها في درجات الحرارة المرتفعة وفي ظروف الأكسدة والتغيرات في ظروف الغسل. ونجم عن التطفير المُوَجَّه الموقع و/أو التطفير العشوائي إنزيماتُ بروتياز قلوية جديدة، مثل دورازيم durazyme، وماكزاپِم maxapem، وپورافِست purafest، في حين تم الحصول على منتجات سابتيليزين جديدة ذات خصائص محسَّنَة من حيث النوعية والثباتية اعتماداً على طريقة التطور الموجّه.

يُنظَر إلى بعض أنواع جراثيم العُصَيات Bacillus بوصفها مضيفاً ذا قيمةٍ لإنتاج الإنزيمات الصناعية نظراً لتصنيفها جراثيم آمنة عموماً (Generally Regarded As Safe (GRAS، ولقدرتها على إنتاج كميات كبيرة من الإنزيمات خارج الخلوية. ويجري العمل على اعتماد طرائق المجينات البيئية الشاملة metagenomic التي تساعد على اكتشاف تنويعات طبيعية وجزيئية بوصفها تقانات حديثة لعزل مصادر مكروبية جديدة تتمتع بفعالية محسّنة من البروتياز القلوية.

2- التطبيقات البيئية: تعود التقارير المبكرة للتطبيقات الخلوية والإنزيمية في رَصد monotoring المواقع البيئية والصناعية- مثل استخدام الحسّاسات الحيوية البيئية environmental biosensors- إلى عام 1993، تلا ذلك تطوير طرائق واستراتيجيات جينية لتصميم متعضيات دقيقة قادرة على التخلّص من الملوِّثات البيئية، وشملت تنظيم التعبير الجيني لإعطاء فعالية حَفزٍ عالية في ظروف الشِّدَّة البيئية مثل وجود مركّبات سُمِّيَّة وإحداث تغييرات في قطاعات domains بروتينات تنظيمية تتحكّم بفعاليات التقويض، أو اصطناع مسارات استقلابية metabolic pathways جديدة، أو بمُشاركاتٍ بين هذه الطرائق.

انصبت جهود الباحثين على دراسة السلالات المكروبية التي تؤدي إنزيماتها دوراً في تطبيقات الاستحالة الحيوية biotransformation والاستصلاح الحيوي bioremediation. فقد دُرِست بعناية إنزيمات هدروكسيلاز الموليبدِنيوم molybdenum hydroxylases التي تحفز تفاعل الهدركسلة الجرثومية لمركّبات عديدات الحلقات العطريّة المتخالفة N-heteroaromatic compounds، وإنزيمات ring-opening 2,4-dioxygenases التي تؤدّي دوراً في التَّدَرُّك الجرثومي لـ كوينالدين quinaldine، وكان الهدف من وراء هذه الدراسات المستفيضة تحسين الإنزيمات المنخرطة في التَّدَرُّك البروتيني الهوائي لـلمركّبات العديدات الحلقات العطرية المتخالفة.

3- التطبيقات الطبيّة: يعود الفضل إلى تقانة الدنا المأشوب في إنتاج الجيل الأول من المعالِجات البروتينية (مثل الإنسولين)، في حين أسهمت هندسة البروتينات في إيجاد جيلٍ ثانٍ من المنتجات البروتينية العلاجية التي تتمتع بخصائص نوعية من حيث التطبيقات، نجمت عن طفرات أو غروزات أو حذوفات أو دمج. وقد أثمرت هاتان التقانتان ذخيرةً من البروتينات العلاجية تضم الإنتِرفِيرونات interferons ألفا وغاما وإنتِرلوكينات interlukins 2، 6، 8؛ وإريثروپويتين Erythropoietin والألبومين البشري وهرمون النمو البشري وإنزيم السترِبتوكيناز streptokinase والعامل المحَفِّز لمستعمرات الخلايا المحبّبة Granulocyte Colony Stimulating Factor (FSC-G) والعامل المُحَفِّز لمستعمرات الخلايا المحبّبة والوحيدات Granulocyte  (Monocyte Colony Stimulating Factor (GM-CSF.

تتنَوَّع التطبيقات الطبية لهندسة البروتينات، وأهمها المعالجات البروتينية للسرطانات، إذ على الرغم من التحسُّن الحاصل في نسب البقيا survival والبقيا الخالية من المرض disease free survival التي حققها طب الأورام باستعمال العلاجات الكيميائية والشعاعية التقليدية؛ يبقى السرطان أحد أهم أسباب الوفيات والأمراض عند البشر، ويُشَكِّل عبئاً صحياً واجتماعياً واقتصادياً على مجتمعات العالمين المتقدم والنامي.

ساهمت هندسة البروتينات كثيراً في معالجة السرطانات بصنع أضداد وحيدة النَّسيلة monoclonal antibodies نوعية مُوجَّهة لاستهداف الخلايا السرطانية مثل Trastuzumab, وPertuzumab،
وCetuximab وPanitumumab وRituximab. ولا تقتصر تطبيقات هندسة البروتينات على معالجة السرطان، بل تتعداه إلى الأمراض القلبية الوعائية Abciximab، والأمراض الالتهابية Adalimumab،
وEfalizumab. كما أحرزت هندسة البروتينات- مع تقانة البروتينات المأشوبة- انتصارات على جبهات علاجية أخرى، مثلاً أمكن اصطناع جسيمات بروتينية مستضدة مأشوبة recombinant antigenic proteins تشبه البروتينات النوعية المُغلِّفَة للفيروسات قادرة على حفز الجسم لتطوير مناعة خلطية humoral immunity وإنتاج أضداد نوعية تقضي على هذه الأنماط الفيروسية. وجرى استثمار هذه الإنجازات في تطبيقات علاجية جديدة تُعْرَف باللقاحات الوقائية من السرطان، حَظي عددٌ منها-مثل غارداسيل
gardasil (شركة مِرك Merck) وسِرفاريكس Cervarix (شركات غلاكسوسميث كلاين GlaxoSmithKline)، التي تتمتع بالقدرة على منع حدوث بعض أنواع سرطان عُنق الرحم، ولقاحات رِكومبيـفاكسrecombivax HB (شركة مِرك Merck)، وتوينريكس twinrix (شركة غلاكسوسميث كلاين GlaxoSmithKline) لأنماط معيّنة من سرطان الكبد- بموافقة إِدارة الأغذية والأدوية الأمريكيّة .Food and Drug Administration (FDA)

4- تطبيقات لإنتاج بوليمرات حيوية: تُعَدّ كثيرات الببتيد موادّ حيوية نظراً لخصائصها النوعية البيولوجية والكيميائية والفيزيائية. وقد اعتمدت هندسة البروتينات والتَّجَمُّع الذاتي للجزيئات الضخمة macromolecules لإنتاج مواد حيوية ببتيدية مثل كثيرات الببتيد الشبيهة بالإيلاستين والبوليمر الشبيه بالحرير، إضافة إلى البوليمرات الجرثومية التي تَمَّ التطَرُّق إليها. وكذلك سمحت القُدرات الكبيرة لهندسة البروتينات بتطوير قِطاعات بروتينية protein domains قابلة للاستعمال في إنتاج مواد حيوية جديدة ذات تطبيقات طبية وهندسية، مثل تشكيل الهلامات المائية hydrogels.

5- تطبيقات التقانة الحيويّة النانَوِيَّة nanobiotechnology: يطمح العديد من الباحثين في مجال التقانات الحيوية النانوية إلى تركيب منظومات تقانية نانوية وتجميعها وتحويلها إلى بُنى وأجهزة وظيفية، بيد أن هذا الطموح واجَهَ -لأمدٍ طويل- الكثير من العقبات والصعوبات التي حدّت من إمكان تحويله إلى واقع تطبيقي عملي. غير أن نظرة متبصِّرة إلى المواد الحيوية ستجعل المرء يدرك مستوى التنظيم الفائق للمواد الحيوية بدءاً من المستوى النانوي صعوداً إلى المستوى الضخم macroscale.

تُستعمَل المواد الحيوية -مثل البروتينات والكربوهدرات والشحوم- في اصطناع نسج حيوية في بيئات مائية وظروف فيزيولوجية لطيفة، تخضع فيها عملية الإنتاج الحيوي إلى تَحَكُّمٍ على المستوى الجيني.

6- تطبيقات إنزيمات الأكسدة/الإرجاع وبروتيناتها: يمكن تعديل بروتينات الأكسدة والإرجاع وإنزيماتها بتقانات هندسة البروتينات للاستفادة منها في الأجهزة النانوية المُستعمَلة في الاستشعار الحيوي، وكذلك في تطبيقات التقانة الحيوية النانَوِية. وقد استرعى تطبيقان للإنزيمات ذات فعالية الأكسدة/الإرجاع اهتماماً خاصاً، هما بِناء حَفّاز معتمد على الحموض النووية وإعادة نَمْذَجَة شبكةٍ ضمن جُزَيئِيَّة لنقل الإلكترون intra-molecular electron transfer network remodeling، وتتمحور الجهود في هذا المجال على مجموعة إنزيمات السيتوكروم cytochrome P450، مثل إنزيم الهيم مونو أُكسيجِناز heme monooxygenase والمنخرطة في الاصطناع الحيوي والتَّدَرُّك الحيوي لمركّبات الاستقلاب وفي أكسدة المركّبات الحيوية الغريبة xenobiotics.

7-التطبيقات الصناعية: للإنزيمات تطبيقات هائلة في عَددها وتنوعها، ويعود ذلك إلى قدرتها على القيام بدور الحفّازات الحيوية biocatalysts في الكيمياء العضوية التركيبية؛ نظراً لانتقائِيَّتِها الفراغية العالية الضرورية لتخليق بعض المركّبات العديمة التناظر المرآتي chiral compounds، وكذلك حيثما تكون ظروف التفاعل مهمّة لحصوله، كما هي الحال في انقلاب conversion المركّبات غير المستقرّة labile compounds وفي خطوات الحماية protection أو إزالة الحماية deprotection أو عند الحاجة لانتقائيةٍ كيميائية chemoselectivity أو لانتقائيةِ تفضيل اتجاه معيّن regioselectivity لرابطة كيميائية.

وعلى الرغم من أهميتها على المستويين البحثي والصناعي؛ فقد حالت جملةٌ من العقبات والصعوبات دون استخدام الإنزيمات موادَّ مُحَفِّزة صناعياً، من هذه العوامل تكلفة إنتاجها المرتفعة وفقدانها للفعالية في الظروف غير الطبيعية ونوعية التفاعل الإنزيمي تجاه ركيزة واحدة؛ الأمر الذي يَحدّ من استعماله على رُكازات أخرى قد تكون شديدة الشبه بالرُّكازة الأصلية.

لقد مَكّن التقدم العلمي الحاصل في حقل هندسة البروتينات من تعديل الإنزيمات والتوَصُّل إلى حفّازات حيوية biocatalysts قادرة على الإسهام في دفع عجلة التطبيقات الصناعية قُدُماً. ونجم عن العمل الدَّؤوب في هذا المجال زيادة في وفرة «ذخيرة» الركائز التي يمكن استعمالها، وكذلك إمكان تعديل انتقائية selectivity الإنزيم.

تتزايد أهمية الإنزيمات المهندَسَة في عمليات المعالجة المسبّقة للمصادر المتجَدِّدة كمواد بِدئية، كما هي الحال قي تَدَرُّك السلولوز الخشبي lignocellulose لصنع الوقود الحيوي biofuels من الجيلين الثاني والثالث.

وحتى أمدٍ قريب كانت العمليات الحيوية المعتمدة على إنزيم معيّن تُصَمَّم وفق محدوديات الإنزيم. أما في الوقت الراهن فيُهندَس الإنزيم ليوائِم خصوصيات العملية. وقد غدا التحفيز الحيوي تقانة ناضجة كمُحَصِّلة لموجات عديدة ومتتابعة من الابتكارات. في الماضي كان بالإمكان استعمال النمط البَرّي من الإنزيمات فقط، غير أنّ اقتحام تقانة الدنا المأشوب لحقل التطوير والابتكار الصناعي مَكَّن من تنسيل إنزيمات مهمّة من وجهة نظرٍ تطبيقية والتعبير عنها.

يبين الشكل (3) مخططاً انسيابياً لهندسة جزيئات الإنزيمات الصناعية في حال كانت المعلومات البنيوية معلومة أم لا. «البنية معلومة» تعني أن المعلومات البنيوية قد حُدِّدَت عن طريق البيانات التجريبية المنشورة (مثلاً أشعة X أو NMR) أو بواسطة نمذجة التشاكل. أما «البنية غير معلومة» فتعني أن المعلومات البنيوية لا يمكن الحصول عليها من البيانات التجريبية المنشورة (أشعة X أو NMR) أو بوساطة نمذجة التشاكل.

الشكل (3) طرائق هندسة الجزيئات وإجراءاتها لتحسين الأداء الحفزي للإنزيمات الصناعية.

8- تطبيقات أخرى: تشمل تطبيقات هندسة البروتينات أيضاً تطبيقات ذات أهمية صناعية و/أو دوائية إنزيمية مهمّة، ومن ذلك كولِستِرول أُكسيداز cholesterol oxidase، وسيكلودِكسترين غلوكوزيل ترانسفيراز cyclodextrin glycosyltransferase والإنزيم البشري بوتيريل كولين إستِراز butyrylcholinesterase والإنزيمات الجرثومية غلوكو أميلازات glucoamylases، والليباز من مصادر مختلفة وإنزيمات فسفو ليباز وفيتاز phytase.

لقد كشفت الدراسات التي أجريت على إنزيمات تعمل بظروف قاسية extremozymes (وهي إنزيمات مُستَحصَلة من أنماط لكائنات تعيش في ظروف حياتية شديدة القسوة extremophiles) اختلافات في بنيتها وخصائصها الوظيفية التي تجعلها قادرة على العمل في مثل هذه الظروف الصعبة، ومن ثمّ يمكن الإفادة منها في تطبيقات تقانية حيوية وتحسينها باستعمال هندسة البروتينات.

9- تطبيقات جديدة أخرى: شهد العقد المنصرم تطوير أنماط جديدة من البروتينات باستعمال تقنيات هندسة البروتينات التشارُكِيَّة. تدعى هذه البروتينات الرابطة ذات المنشأ غير الغلوبيني المناعي بـ «الأجسام الأليفة» affibodies، وهي تتسم بألفتها العالية؛ وهذا ما سمح باستعمالها في العديد من التطبيقات، منها تصميم أدوات تشخيص وعمليات الفصل الحيوي bioseparation وتثبيط وظيفي واستهداف ڤيروسي وتصوير الأورام في الكائن الحي in vivo tumor imaging ومعالجات السرطانات.

مثلاً بدأت الإنتِئينات inteins -وهي عناصر مضفِّرة للبروتينات- تجد سبيلها إلى العديد من التطبيقات المتنوعة، مثل تنقية البروتينات وتركيب أشباه البروتينات protein semisynthesis وتعديل البروتينات، سواء في الزجاج أم في الحي. وقد أمكن مثلاً استعمال هذه المركّبات بمنزلة لصيقات/شارات tags لتنقية البروتينات التي تُنتِجها النباتات العالية الإنتاجية؛ وهذا مما يُمَكِّن من صنع منتَجات بروتينية ذات خصائص علاجية مهمّة. ومَكَّنَت دراسة فعاليات هذه المواد -الإنتِئينات في انشقاق البروتينات التحللي أو دمجها- من التوَصُّل إلى تطبيقات جديدة في هندسة البروتينات واختصاص الإنزيمات وإنتاج المصفوفات الدقيقة والكشف عن أهداف الجينات المعدّلة في النباتات وتفعيلها.

كذلك سمحت تطبيقات هندسة البروتينات الغَرزِيَّة insertional protein engineering من تطوير حسّاسات حيوية. ويبرز دور هندسة البروتينات في تصميم ما يعرف ببروتينات إصبع الزنك وإنتاجها، التي تنبع أهميتها من قدرتها على الارتباط بالدنا (DNA) والتحَكُّم بالتعبير الجيني؛ وهو ما يحمل إمكان استخدامها في كبح الجينات الوَرَمِيَّة oncogenes أو دمج ببتيدات من بروتينات إصبع الزنك مع قطاعات domaines مفعِّلة أو مثبّطة؛ وبذلك يمكن الحصول على ما يشبه القاطع switch الذي يُمكن التحكُّم بتشغيله أو إيقافه.

وساهمت التطبيقات الجديدة لهندسة البروتينات في تحسين أداء الإنزيمات المُدَرِّكَة (المُفَكِّكَة) للسلولوز الخشبي التي تُستعمَل في إنتاج الوقود الحيوي والتي يعوق انخفاضُ كفاءتِها من إمكان إنتاجِه بكمياتٍ كبيرة، ويؤثر سلباً في التكلفة. وبهذا سمحت تقانات هندسة البروتينات من تحسين أداء هذه الإنزيمات والإنزيمات المُصَنِعة للوقود الحيوي، وخَفَّضَت من تكلفة الإنتاج.

تشمل التطبيقات الحديثة لهندسة البروتينات أيضاً رفع كفاءة الوصل الكهربائي بين الحَفّازات الحيوية والأقطاب الكهربائية ضمن إطار يعرف بهندسة الحفّازات الحيوية. وساعدت تقانة هندسة البروتينات على بزوغ اختصاصات وحقول بحثيَّة جديدة مثل «هندسة الڤيروسات» virus engineering التي تُعَدَّل في إطارها الجزيئات الڤيروسية اعتماداً على تقانات هندسة البروتينات للحصول على جزيئات ذات تطبيقات طبية أو تقانية حيوية أو تقانية نانوية؛ إذ يمكن استعمال الڤيروسات المُعدَّلة بشكل لقاحاتٍ أو نواقل في المعالجة الجينية أو لإيتاء الدواء الاستهدافي، وكذلك في التصوير الجزيئي وفي تصميم أجهزة نانويّة ومواد نانويّة وبنائها. تتطلب جميع هذه التطبيقات ثباتية فيزيائية للجزيئات الڤيروسية، وهو ما أمكن تحقيقه اعتماداً على هندسة البروتينات.

يُعَدّ تعديل ثمالات السيستئين ضمن جزيء البروتين تطبيقاً آخر مهمّاً لهندسة البروتينات؛ نظراً لما يُحدِثه هذا التعديل من تَنَوُّعٍ في وظائف البروتين، على الأخص في اصطناع بروتينات سكرية glycoproteins في الزجاج. ويمكن أن تُسهِم هذه الطريقة أيضاً في تطوير أدوية بروتينية جديدة أو تحسين عمر النصف للبروتينات العلاجية وخفض سُمِّيَّتِها ومَنْع تَطَوُّر ظاهرة المقاومة لأدوية متعددة.

واكتسبت بروتينات السيكلوتيدات شعبيةً في تطبيقات هندسة البروتينات؛ نظراً لخصائص هذه البروتينات النباتية المُكَوَّنَة من ببتيدات صغيرة غنية بالروابط الثنائية الكبريت وثباتيتها الفائقة ومقاومتها للتدرك الإنزيمي أو الكيميائي أو الحراري؛ وهذا ما جعلها نماذج جزيئية مهمّة يمكن الاحتذاء بها لهندسة العديد من البروتينات وفي تطبيقات تشمل تصميم الأدوية.

يلخص الشكل (4) الطرائق الرئيسية التي تؤدي إلى إنزيمات ذات خصائص معينة.

الشكل (4) مخطط عام للمفاهيم المستعملة في التوصل إلى إنزيمات تتمتع بالخصائص المرغوبة.

 

مراجع للاستزادة: -T. Davids, M. Schmidt, Böttcher D, Bornscheuer UT. Strategies for the discovery and engineering of enzymes for biocatalysis. Curr Opin Chem Biol. 2013. -KA. Dill, SB. Ozkan, et al., The protein folding problem: when will it be solved? Curr Opin Struct Biol. 2007. - DT. Eriksen, J. Lian, H. Zhao, Protein design for pathway engineering. J. Struct. Biol. 2014;185:234-242. -”HPV Vaccines”. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 2010-10-15. -B.Turanli-Yildiz, C.Alkim and ZP. Cakar, Protein Engineering Methods and Applications. “Protein Engineering”, 2012. -Therapeutic Proteins Market to 2017 - High Demand for Monoclonal Antibodies will Drive the Market.-KM. Ulmer, Protein engineering. Science. 1983.- JM. Woodley, Protein engineering of enzymes for process applications. Current Opinion in Chemical Biology 2013. - H.Yang, J. Li, et al., Molecular engineering of industrial enzymes: recent advances and future prospects. Appl Microbiol Biotechnol. 2014. -http://www.marketresearch.com/GBI-Research-v3759/Therapeutic-Proteins-High-Demand-Monoclonal-6511062/.

---

- التصنيف : علم الحياة (البيولوجيا) - النوع : علم الحياة (البيولوجيا) - المجلد : المجلد الرابع مشاركة :