انزيمات (هندسه)

Enzyme engineering - Ingénierie enzymatique

الإنزيمات (هندسة -)

وفاء شومان

الآلية المتبعة لزيادة كمية الإنزيم المنتجة

الآلية المستخدمة للحصول على إنزيم جديد

يستخدم تعبير هندسة الإنزيمات enzyme engineering في الوقت الحالي إلى الإشارة للتغيير الذي يحدث في بنية الإنزيم ووظيفته نتيجة تغيير وتحوير في الجين المسؤول عنه، وذلك من خلال مجموعة من التقنيات الحيوية الحديثة بهدف إنتاج إنزيمات أكثر فائدة للصناعة وذات أهمية تطبيقية أكثر. يتحقق ذلك من خلال زيادة كمية الإنزيمات المنتجة، أو إنتاج إنزيمات جديدة، أو زيادة الثباتية الحرارية للإنزيمات بتغيير محتواها من الحموض الأمينية، أو زيادة ثباتيتها لدرجات حموضة مختلفة، أو تحسين الخصائص الحركية للإنزيمات، أو تعزيز دقة التفاعل بين الإنزيم والمادة الأساسية التي يعمل عليها أو غيرها.

قبل البدء بذكر طرائق هندسة الإنزيمات وتعديلها، سيتم تعرف الإنزيمات عموماً والآلية التي تحدد تركيبها ووظيفتها.

تعرف الإنزيمات بأنها أنواع متخصصة من البروتينات، لها وظائف حيوية مختلفة، تنتج في خلايا الكائنات الحية وتتميز بقدرتها على تحفيز التفاعلات الحيوية وتنشيطها. وعلى الرغم من اختلاف أنواع الإنزيمات في الكائنات الحية المختلفة تتشابه بكونها مؤلفة أساساً من بروتينات تتكون بدورها من حموض أمينية تشكل البنية الأولية لكل بروتين. إن نوع الحموض الأمينية وعددها وطريقة ارتباطها بعضها ببعض بسلسلة خطية يتحدد بالشيفرة الوراثية للدنا DNA المحدِّدة لهذا البروتين، في حين تتحدد وظيفة البروتين على نحو غير مباشر من خلال مستويات مختلفة من البنيات الثانوية والثالثية والرابعية الخاصة بالبروتين. ويتم تحديد تركيب هذه الإنزيمات وبنيتها من خلال المعلومات الوراثية الموجودة في الجينات على شكل شيفرة مسؤولة عن إنتاج أنواع محددة من الإنزيمات، حيث يحدد نوع النوكليوتيدات وتتاليها في الشيفرات نوع الحموض الأمينية المكوِّنة لها وعددها وتتاليها، لذلك فإن التغيير بالتركيب النوكليوتيدي للشيفرة المحمولة ضمن هذا الجين سيؤدي إلى تغيير بالحمض الأميني الذي تُشَفِّر له، مما يؤدي إلى تغيير بالإنزيم الذي سينتج منها (الشكل 1). اعتماداً على هذا المبدأ تطورت مجموعة التقنيات التي تتضمن إحداث تغيير وتعديل بالإنزيمات من خلال إحداث تغييرات على الشيفرة الوراثية المسؤولة عنها، وهذا ما يسمى بهندسة الإنزيمات التي هي أحد المجالات التطبيقية للهندسة الوراثية.

الشكل (1) التغيير بالتركيب النوكليوتيدي للجين وانعكاسه على البروتين (الإنزيم) الناتج.

هناك عدة طرائق وآليات متبعة بهندسة الإنزيمات توافق الهدف المراد تحقيقه، حيث تكون الغاية في بعض الحالات زيادة في كمية الإنزيم المنتجة من دون تغيير في تركيبه ووظيفته، وفي حالات أخرى يكون الهدف تعديلاً وتغييراً وتحسيناً في وظيفة الإنزيم ليلبي الهدف المرجو منه، وستدُرس هاتان الحالتان في الفقرات التالية:

1 - الآلية المتبعة لزيادة كمية الإنزيم المنتجة:

هناك مبدآن أساسيان يمكن استخدامهما لزيادة إنتاج كمية إنزيم معين، يتمثل الأول بنقل الجين المسؤول عن إنتاج الإنزيم المعني من الكائن الأساسي إلى كائن آخر يتميز بكفاءة أعلى بإنتاج الإنزيم، في حين يعتمد الثاني على زيادة عدد نسخ الجين المسؤول عن إنتاج الإنزيم المرغوب.

سمحت تقنيات الدنا المؤشَّب recombinant DNA بنقل جينات مسؤولة عن إنزيمات مهمة ومفيدة من كائن إلى كائن آخر. يتم ذلك عندما يوصّف إنزيم بأنه جيد ومهم صناعياً، ولكن يوجد كائنات تنتجه بكميات قليلة وغير مناسبة للاستخدام الصناعي. يتم تجاوز هذه المشكلة من خلال عزل الجين المسؤول عن هذا الإنزيم وإدخاله ضمن خلايا كائنات دقيقة مضيفة مناسبة لها القدرة على إنتاجه بكمية أكبر من تلك المنتجة بالكائنات الأصلية، ويمكن بهذه الطريقة إنتاج إنزيمات صناعية بكمية كبيرة وبدرجة عالية من النقاوة.

مثال ذلك: الإنزيمlipolase المستخدم بصناعة المنظفات والذي حسنت فيه صفة إزالة الأصبغة الدهنية. للحصول على هذا الإنزيم تم تحديده وتوصيفه بداية في فطر Humicola lanuginosa، ولكن لم يكن باستطاعة هذا الفطر إنتاجه بكمية مناسبة للاستخدام الصناعي؛ لذلك عُزل الجين المسؤول عن هذا الإنزيم وأدخل في فطر Aspergillus oryzae الذي استطاع إنتاج هذا الإنزيم بكمية كبيرة مناسبة تجارياً، وقد أظهرت التجارب كفاءة هذا الإنزيم و فعاليته وثباتيته وقدرته على العمل تحت ظروف غسيل متباينة من حيث درجات الحرارة والحموضة.

هناك مثال آخر يوضح المبدأ الثاني الذي يعتمد على زيادة إنتاج الإنزيم ونشاطه من خلال زيادة عدد نسخ الجينات المنتجة له. وقد استخدم هذا المبدأ لزيادة نشاط إنزيم penicillin G amidase في بكتريا الأشريكية القولونية .Escherichia coli وأُنجز ذلك من خلال استخلاص الدنا من سلالة منتجة لهذا الإنزيم، ثم هضمه بإنزيم التحديد hind III حيث أعطى قطعاً متباينة في طولها وتتشابه جميعاً بأنها تحمل المقطع النوكليوتيدي ′3-AAGCTT-′5 في نهاياتها الطرفية.

اختيرت قطعة الدنا التي تحمل المعلومات الوراثية الخاصة بإنزيم penicillin G amidase وأضيفت إلى الكوزميد cosmid (وهو ناقل يستخدم في عمليات التنسيل cloning لقطع دنا يصل طولها إلى نحو 50 ألف شفع نوكليوتيدي)، ثم أعيدت ثانية إلى بكتريا الأشريكية. تم تحديد المستعمرات التي تحتوي الجينات النشطة للإنزيم المرغوب وانتخابها من خلال تثبيطها للكائنات الحساسة لحمض 6-امينو بنيسيلانيك6- aminopenicillanic وتم عزلها، ومن ثم نقل هذا الجين إلى البلازميد pBR322 للحصول على البلازميد المؤشَّب (المكون من دنا البلازميد مع دنا الجين المسؤول عن إنزيم penicillin G amidase)، ثم نقل البلازميد المؤشَّب لاحقاً إلى بكتريا الأشريكية مرة ثانية. إن الخلايا البكترية المهندسة وراثياً (المحورة وراثياً) والمحتوية على البلازميد المؤشَّب الموجود بعدد من النسخ يعادل 50 نسخة (هذا يعني وجود 50 نسخة أيضاً من الجين المرغوب في الخلية)، لها القدرة على إنتاج إنزيم penicillin G amidase بكمية أكبر بكثير من السلالات البكترية الأساسية (التي تحوي نسخة واحدة من الجين). هذه الكمية الكبيرة المنتجة من الإنزيم تلبي الحاجات الصناعية إضافة إلى أنها أكثر نقاوة من تلك المنتجة أصلاً من السلالة الأبوية.

2 - الآلية المستخدمة للحصول على إنزيم جديد أو لتعديل عمل بعض الإنزيمات من خلال الطفرات الموجهة لمواقع محددة (SDM) Site - Directed Mutagenesis:

هي الآلية التي يتم من خلالها إحداث طفرات في مواقع محددة من جزيئة الدنا ، وقد تحدث على مستوى نوكليوتيد واحد، سواء باستبدال substitution نوكليوتيد بآخر أم بحذف deletion نوكليوتيد أم بإضافة نوكليوتيد جديد. عند استخدام هذه الآلية يتم التحديد المسبّق لنوع الطفرة المرغوبة ومن ثم يتم القيام بها، ولا يتم من خلال ذلك تغيير بتركيب الجين فحسب وإنما تغيير بتعبيره أيضاً، أي المنتج (البروتين أو الإنزيم) الناتج منه. فيمكن على سبيل المثال أخذ القرار بتغيير حمض أميني معين في سلسلة عديد الببتيد لبروتين محدد (أو إنزيم) من خلال تغيير الشيفرة الوراثية الخاصة بذلك الحمض الأميني. إن تغيير الحمض الأميني سيؤدي غالباً إلى تغيير خصائص البروتين (أو الإنزيم). يتم ذلك على مراحل، تبدأ بعزل الجين المسؤول عن الإنزيم اعتماداً على استخلاص الرناRNA المرسال الخاص بإنزيم محدد و تحويله إلى cDNA (الدنا المكمِّل complementary DNA للرنا الرسول عن طريق النسخ بإنزيم النسخ العكسي reverse transcriptase للحصول على سلسلة دنا مكملة لسلسلة الرنا المرسال)، ثم يتم تعرف التتالي النوكليوتيدي للجين gene sequence، ويتم تحديد موقع النوكليوتيدات المراد تغييرها، ويكون ذلك مبنياً على دراسة مسبّقة للإنزيم وتركيبه من الحموض الأمينية وكذلك معرفة بنياته الأولية والثانوية، ويتم ذلك غالباً باستخدام نماذج حاسوبية يمكنها توفير تنبؤات عن التغيير الذي يمكن أن يحصل على الإنزيم بسبب تغيير نوكليوتيد معين.

يتم بعد ذلك إجراء الطفرة على الموقع المختار، وتُسمى الطفرة الموجَهة لموقع معين (SDM)، ويتم عادة تغيير شيفرة codon واحدة فقط بالتجربة الواحدة (سواء بتغيير نوكليوتيد واحد أو اثنين أو ثلاثة حداً أقصى، مع التذكير بأن الشيفرة مكونة من 3 نوكليوتيدات فقط). تحدث الطفرة الموجهة تغييراً بإحدى شيفرات الجين مؤدية بذلك إلى تغيير بالحمض الأميني في جزيئة الإنزيم المدروس، ويتم بعد ذلك اختبار الإنزيم الجديد الذي تكوّن لمعرفة نوع ومستوى التحسين أو التعديل الذي طرأ عليه.

ظهرت فكرة إحداث طفرات في مواقع محددة إلى الوجود من خلال الأبحاث التي أجريت في مخبر العالم السويسري ﭬايسمان Charles Weissmann عام 1973م باستخدام hydroxycytidine -4N الذي يحرض على تحويل GC إلى AT، ولكنها كانت محدودة الاستخدام بسبب نوعية الطفرات التي يمكن أن تنتجها، وكان قد أوضح العالمان الأمريكيان هاتشسن Clyde Hutchison وإدجل Marshall Edgell عام 1971م إمكانية إنتاج طفرات باستخدام قطع صغيرة من دنا العاثي X174 بوجود إنزيمات التحديد، وتمكن هاتشسن Hutchison لاحقاً وبالتعاون مع العالم الكندي سميث Michael Smith عام 1978م من إيجاد طريقة أكثر كفاءة بإحداث طفرات موجهة، وذلك باستخدام مقاطع نوكليوتيدية قصيرة تعمل بادئات تستطيل لتستكمل تركيب سلسلة الدنا باستخدام إنزيم تكثيف الدنا DNA polymerase.

إن المبدأ الأساسي الذي تعتمد عليه أغلب تقنيات الطفرات الموجهة هو تصنيع مقاطع صغيرة من الدنا هي البادئات primers تكون مكملة للدنا القالب حول الموقع المراد إحداث الطفرة به. بما أن البادئات المصنعة مكملة للدنا القالب في المنطقة حول تلك التي تحمل الطفرة، فيمكنها أن تتهجن معه اعتماداً على مبدأ التكامل النوكليوتيدي بين البادئات والدنا القالب الذي يحوي الجين المرغوب ثم تتم الاستطالة وتصنيع السلسلة الجديدة باستخدام إنزيم تكثيف الدنا التي هي نسخة جديدة عن الجين تحمل الطفرة. يُدخل الجين الجديد لاحقاً في خلية بكترية مضيفة ليتم مكاثرتها والحصول على المستعمرة التي تحمل الطفرة بكمية كبيرة.

هناك عدة طرائق لإحداث الطفرات الموجهة، وهي تتباين بكفاءتها والأساس الذي تعتمد عليه، وقد تم بعد عام 2000م الاستبدال بعدد من طرائق إحداث الطفرات الموجهة الطرق التي تعتمد علي تفاعل البوليمراز المتسلسل (PCR) polymerase chain reaction لكونها أكثر كفاءة وأكثر سهولة، ويهدف الـ PCR إلى زيادة عدد النسخ من قطعة معينة من الدنا للحصول على مليارات النسخ المتطابقة منها، وذلك باستخدام إنزيم تكثيف الدنا وبادئات تحدد أماكن بداية النسخ والتضاعف وبوجود النوكليوتيدات ثلاثية الفسفات التي تستخدم بتصنيع السلسلة الجديدة.

فيما يأتي بعض الطرائق الأساسية بإحداث الطفرات الموجهة مخبرياً:

أ- طريقة كَنكِل Kunkel:

أدخل كَنكِل وزملاؤه عام 1987م تقنية جديدة سمحت باختصار مرحلة اصطفاء الجينات الطافرة ضمن الخلايا البكترية. يتم ذلك عن طريق إدخال الناقل الذي يحوي الجين الذي ستحدث به الطفرة لسلالة من الأشريكية القولونية E. coli التي تحمل نقصاً بإنزيمين هما dUTPase و uracil deglycosidase. إن غياب الإنزيم dUTPase يمنع انحلال (تحليل) اليوراسيل ثلاثي الفسفات dUTP (هو نوكليوتيد يحل مكان الثيمين ثلاثي الفسفات dTTP في جزيئة الرنا) مما يؤدي إلى زيادة محتوى الخلية من اليوراسيل. أما فقد إنزيم uracil deglycosidase فإنه يمنع استبعاد اليوراسيل من جزيئة الدنا الجديدة التكوين. قد يتعرض تناسخ دنا الناقل في سلالة البكتريا الخالية من الإنزيمين المذكورين لإدخال خاطئ لليوراسيل بدلاً من التيمين في سلسلة الدنا الجديدة، وذلك بسبب توفر اليوراسيل بكمية كبيرة مما يؤدي إلى الحصول على دنا يحوي بعض نوكليوتيدات اليوراسيل ثلاثي الفسفات. تستخلص هذه النسخة من الدنا وتستخدم كقالب للحصول على الطفرة. في المرحلة التالية تستخدم بادئات تحتوي على الطفرة المطلوبة لتتهجن مع الدنا ولتبدأ عملية نسخ لجزيئة جديدة مزدوجة السلسلة من الدنا، ولكن إحدى سلسلتيها تحمل طفرة وتحوي التيمين والأخرى لا تحمل طفرة وتحوي اليوراسيل. يعامل هذا الدنا بإنزيم uracil deglycosidase مما يؤدي إلى استبعاد اليوراسيل من سلسلة الدنا القالب ثم يوضع بوسط قلوي مما يؤدي إلى تحطيم الدنا وانحلاله لكونه يصبح حساساً للوسط القلوي بعد استبعاد اليوراسيل، ويبقى الدنا الذي يحمل الطفرة سليماً وحيداً، وهو الذي سيستخدم لإنتاج الإنزيم الجديد الطافر.

ب- طريقة تطفير كاسيت cassette mutagenesis:

لا تحتاج طريقة إحداث الطفرات الموجهة إلى استخدام بادئات ولا إلى استكمالها باستخدام إنزيم البوليميراز. يتم بهذه الطريقة تصنيع قطعة من الدنا وإدخالها ضمن بلازميد (البلازميد عبارة عن جزيئة دنا حلقية تستخدم ناقلاً vector بعملية الاستنساخcloning ). تتضمن الطريقة عملية هضم بإنزيمات التحديد (إنزيمات تتعرف مقطعاً نوكليوتيدياً معيناً وتقطع جزيئة الدنا عندها) لموقع محدد على دنا البلازميد ثم تتبع بعملية ربط دنا البلازميد مع شفع من المقاطع النوكليوتيدية المتكاملة التي تحتوي الطفرة في الجين الهدف. يستخدم إنزيم التحديد نفسه لهضم دنا البلازميد والمقاطع النوكليوتيدية منتجة بذلك نهايات قابلة للتكامل والارتباط بعضها ببعض. تتميز هذه الطريقة بكفاءتها العالية بإنتاج الطفرات ولكن ذلك يتوقف على وجود مواقع لإنزيمات التحديد قريبة من المكان المراد إحداث الطفرة به.

جـ - إحداث الطفرات الموجهة من خلال تفاعل البوليمراز المتسلسل (PCR)site-directed mutagenesis PCR:

طريقة أخرى لإحداث الطفرات الموجهة تكون بأخذ الجين الأساسي (النسخة الأصلية من جزيئة الدنا) وتحويلها إلى نسخة طافرة من خلال تفاعل البوليمراز المتسلسل PCR ، عن طريق إيجاد ارتباط بين مقاطع نوكليوتيدية قصيرة ومفردة (بادئات) ونسخة الجين الأساسية (التي تستخدم قالباً لتصنيع سلاسل جديدة من الدنا) اعتماداً على مبدأ التكامل النوكليوتيدي مع الحرص على وجود نوكليوتيد محدد ضمن البادئة لا يتكامل مع جزيئة الدنا الأصلية فيشكل ما يسمى بالارتباط الخاطئ mismatch، وهو المكان الذي سيحمل الطفرة لاحقاً. يمكن البدء بكمية قليلة جداً من جزيئات الدنا الأساسية والحصول منها على كمية كبيرة جداً من جزيئات الدنا الطافر. يتم بعد ذلك استخدام منتجات الـ PCR لإدخالها ضمن ناقل، ومن ثم ضمن خلية بكترية مضيفة بهدف إكثارها والحصول على عدد كبير من النسخ الطافرة التي يتم إخضاعها لاحقاً لتحليل التتالي النوكليوتيدي لمعرفة التركيب الدقيق لهذا الجين الطافر. تستخدم هذه الطريقة لإحداث الطفرات التي تحدث بالنهايات الطرفية للجين.

في حال الرغبة بإحداث طفرة محددة بنوكليوتيد واحد في وسط الجين يمكن أن يتم ذلك باستخدام أربع بادئات بحيث تُستعمل بادئتان للإحاطة بالجين من النهايتين الطرفيتين والبادئتان الأخريان تغطيان وتحدثان الطفرة في منتصف الجين الناتج من عملية المكاثرة أو التضاعف. يتم ذلك بإحداث تفاعلين PCR للحصول على المنتج المرغوب على شكل نصفين للقطعة (للجين)، يتم بعد ذلك ربطهما معاً من خلال تفاعل ثالث للـ PCR تُستخدم فيه البادئتان الطرفيتان فقط للحصول على المنتج الجديد الطافر (الجين الجديد) (الشكل 2). وبمجرد الحصول على الجين الطافر يُستخدم الموقعان الإنزيميان الجانبيان لهضم القطعة والحصول على نهايات محددة تستخدم بإدخال الجين الجديد إلى الناقل، ومن ثم إلى المضيف البكتري للحصول على الإنزيم الجديد (الناتج من الطفرة) المطلوب.

الشكل (2): إحداث طفرة موجهة في منتصف الجين.

د - إنتاج طفرات بالبلازميدplasmid mutagenesis :

يتم بهذه التقنية استخدام شفعين من البادئات التي تحمل الطفرة لمكاثرة كامل البلازميد باستخدام إنزيم تكثيف الدنا عالي الكفاءة Pfu DNA polymerase (يتميز من غيره من إنزيمات التكثيف بثباتية أكبر لارتفاع الحرارة ولقلة الأخطاء في أثناء النسخ وقدرته على مكاثرة قطع دنا طويلة) من خلال تفاعل PCR. يسمح هذا التفاعل بإحداث كسر في الدنا الحلقي المميز للبلازميد، ثم يستبعد الدنا القالب بالهضم بإنزيمات التحديد مثل إنزيم DpnI المختص بهضم الدنا الممثلن، حيث إن كل الدنا الخاص بالبلازميد والمنتج من قبل بكتريا الإشريكية القولونيةE.coli هو ممثلن (تضيف البكتريا جذر الميتيل إلى الدنا لحمايته من الهضم بإنزيمات التحديد الخاصة بالبكتريا التي تحويه)، وعليه فإن جزيئات البلازميد التي أُنتجت في البكتريا ستهضم بالإنزيم (لأنها ستكون ممثلنة)، في حين أن دنا البلازميد الحامل للطفرة والذي أنتج مخبرياً (بتفاعل الـ PCR) لن يكون ممثلناً وبالتالي لن يهضم بالإنزيم.

بعض الأمثلة عن إنزيمات عدلت وظيفتها باستخدام تقنيات هندسة الإنزيمات:

- زيادة كفاءة الإنزيم butyrylcholinesterase (المسؤول عن حلمهة الكوكايين) بمعدل 100 مرة عن الإنزيم الأساسي.

- زيادة حركية الإنزيم B12-dependent dehydratases المفيد بإنتاج الغليسرول و 1، 3- بروبينديول.

- تغيير المادة الأساسية التي يعمل عليها إنزيم lactate dehydrogenase المستخلص من بكتريا Bacillus stearothermophilus بعد تغيير بأحد حموضه الأمينية لتصبح الـmalate بدلاً من الـ ) lactateالمادة الخاصة بالإنزيم الأساسي).

- زيادة كفاءة إنزيماتnitrilases التي تستخدم لتحويل nitriles (سيانيد عضوي) لحموض كاربوكسيليك بمعدل 1,9 مرات.

- زيادة كفاءة الإنزيمين الطافرين CrtO ketolaseوCrtZ hydroxylase بالتصنيع الحيوي للـ astaxanthin بمعدل 20%.

مراجع للاستزادة: - M. Chaplin, Enzyme Technology: Enzyme Engineering, London, South Bank University, Faculty of Engineering, Science and The Built Environment, 2004. -R. A. Chica, N. Doucet and J. N. Pelletier, Semi-rational approaches to engineering enzyme activity: combining the benefits of directed evolution and rational design. Current Opinion in Biotechnology, 2005. -P. A. Dalby, Engineering Enzymes for Biocatalysis. Recent Patents on Biotechnology, 2007. -M. H. Fulekar, A. Singh and A. M. Bhaduri, Genetic engineering strategies for enhancing phytoremediation of heavy metals, African Journal of Biotechnology, 2009. - D. Hilvert, Enzyme Engineering, Chimia, 2001.

---

- التصنيف : التقانات الحيوية - النوع : التقانات الحيوية - المجلد : المجلد الثالث مشاركة :