تشرب ساوذرن

Southern Blot -

 تشرب ساوذرن

تشرب ساوذرن

وفاء شومان

تشرب ساوذرن Southern blot هو طريقة تُستخدَم على نحو روتيني في البيولوجيا الجزيئية للكشف عن تسلسل نوكليوتيدي محدد في عينة من الدنا (الحمض الريبي النووي منقوص الأكسجين) Deoxyribonucleotide Acid (DNA). وقد سُميت هذه التقنية باسم مكتشفها عام 1975 البريطاني إدوين ساوذرن Edwin Southern. ويعتمد تشرب ساوذرن على نقل شدف الـدنا المفصولة عن بعضها بوساطة عملية الرحلان الكهربائي إلى غشاء نوعي؛ ومن ثم الكشف عن قطعة محددة منها باستخدام مسبر probe متخصص من خلال عملية التهجين الجزيئي molecular hybridization.

وتتضمن طريقة العمل عدة مراحل:

1- الهضم الإنزيمي للـدنا: enzymatic digestion of DNA

عند الرغبة بالبحث عن قطعة معيّنة من الـدنا، قد تكون جيناً محدداً ضمن مجين الكائن الحي؛ فلا بد بدايةً من عزل الـدنا من الكائن بشكل نقي، بيد أن الـدنا المكون لمجين genome الفرد كبير جداً، لذلك لا بد من قطعه لقطع بأطوال يسهل التعامل معها، ويكون ذلك باستخدام إنزيمات التحديد (التقييد) restriction enzymes. وتقوم هذه الإنزيمات بالتعرف إلى تسلسلات نوكليوتيدية محددة وقطع الدنا عندها مُنْتِجَة بذلك عدداً كبيراً من الشدف fragments المتباينة بأطوالها وأوزانها الجزيئية.

2- الرحلان الكهربائي electrophoresis:

تُحمَّل شدف الـدنا الناجمة عن الهضم الإنزيمي على وسط مكون من هلامة من الأغاروز agarose gel، ويُفصَل بعضها عن بعض بتعريضها لتيار كهربائي يؤدي إلى هجرتها من القطب السالب إلى القطب الموجب بسرعة تتناسب عكساً مع وزنها الجزيئي؛ بعملية تُسمى الرحلان الكهربائي.

3- نقل الـدنا إلى أغشية نوعية transfer of DNA to specific membranes:

تجري هذه العملية وفق عدة خطوات:

أ- عند وجود شدف كبيرة من الـدنا (أكثر من 15.000bp)؛ فإنها تخضع لمعاملة خاصة قبل نقلها إلى الغشاء النوعي المتخصص، حيث توضع الهلامة (وسط الفصل) بأحد الحموض -كحمض كلور الماء الممدد- الذي يقوم بـإزالة البورينات depurinate (القواعد الآزوتية التابعة للبورين: الأدنين A والغوانين G) مؤدياً إلى تحويل الدنا لقطع أصغر؛ لتسمح بزيادة كفاية عملية نقل الـدنا من الهلامة إلى الغشاء.

ب- توضع الهلامة المحتوية على الـدنا في محلول قلوي مكون أساساً من ماءات الصوديوم NaOH، في حال استخدام طريقة النقل بوجود محلول قلوي alkaline transfer. ويؤدي وجود الدنا بوسط قلوي إلى تحطيم الروابط الهدروجينية الموجودة بين سلسلتي جزيء الدنا وتحويله لدنا مفرد السلسلة، كذلك يُحَسِّن ارتباط نوكليوتيدات الثايمين سالبة الشحنة بالمجموعات الأمينية المُكَوِّنة للغشاء النوعي والموجبة الشحنة؛ ليكون جاهزاً لعملية التهجين الجزيئي التي ستجرى لاحقًا باستخدام مسبر موسوم labeled prob.

ويمكن نقل الـدنا إلى الغشاء النوعي بطريقتين: إما باستخدام وسط قلوي؛ وإما باستخدام وسط متعادل، ويخضع الاختيار بين الطريقتين للنتائج التجريبية، ومن ثم تُعتمد أكثر الطريقتين كفاية؛ علماً بأن الطريقتين تعطيان كفاية متماثلة في أغلب الأحيان.

ج- يوضع الغشاء النوعي (المكون من النتروسلولوز nitrocellulose أو النايلون nylon) فوق الهلامة (أو تحتها وفقاً لطريقة النقل)، ويطبَّق الضغط بالتساوي على الهلامة، إما بعملية الشفط باستخدام مضخة (بهذه الحالة يوضع الغشاء تحت الهلامة)؛ وإما بوضع عدة طبقات من ورق الترشيح (أو محارم ورقية) وفوقها لوح زجاجي يوضع عليه ثقل معيّن لضغط طبقات ورق الترشيح ولضمان الاتصال ما بين الهلامة والغشاء.

كي تتم عملية نقل الـدنا مفرد السلسلة إلى غشاء النتروسلولوز؛ يوضع محلول ملحي مرتفع التركيز -مكون من سيترات الصوديوم الملحية Saline-Sodium Citrate (SSC) - بوعاء في منتصفه ما يشبه المنضدة، وتوضع عليها ورقة ترشيح تغمر بالمحلول الملحي، وتوضع فوقها الهلامة ثم غشاء النتروسلولوز ثم المحارم الورقية ثم الثقل (الشكل 1). تجري عملية انتقال السائل من المحلول الملحي مروراً بالهلامة، ويحمل معه الـدنا من الهلامة، ويستمر بالصعود ليتجاوز أغشية النتروسلولوز ويصل إلى طبقات أوراق الترشيح وفق الخاصة الشعرية، بيد أن حجم جزيئات الـدنا التي يحملها من الهلامة أكبر من مسامات غشاء النتروسلولوز، فلا تستطيع تجاوزه، ويحجز غشاء النتروسلولوز موجب الشحنة جزيئات الـدنا مفردة السلسلة وسالبة الشحنة، وترتبط بالترتيب نفسه الذي كانت عليه في الهلامة بعد نهاية الرحلان الكهربائي. وتستمر العملية مدة ليلة كاملة (12-14 ساعة) حتى يتم انتقال جميع جزيئات الـدنا من الهلامة إلى الغشاء. وبعد نهاية عملية النقل تُسْتَبْعَد طبقات أوراق الترشيح (أو المحارم الورقية)، وتُسْتَبْعَد الهلامة، ويُحْتَفَظ فقط بالغشاء الحامل للـدنا بشكل مفرد السلسلة بين ورقتي ترشيح جافتين.

الشكل (1) مراحل تشرب ساوذرن.

د- يُعرّض الغشاء للحرارة العالية (تسمى عملية خبز الغشاء membrane baking) في فرن حراري سواء بوجود تفريغ للهواء أم بعدم وجوده، وبدرجة حرارة 80oس مدة ساعتين بهدف تثبيت الـدنا على الغشاء ولمنع فقده عند تعريض الغشاء لعمليات الغسل في المراحل اللاحقة. وتختلف ظروف الخبز القياسية بحسب نوع الغشاء، حيث يُكْتَفى بتعريض الغشاء للأشعة فوق البنفسجية مدة خمس دقائق لتثبيت الـدنا في حال استخدام غشاء النايلون.

4- التهجين الجزيئي molecular hybridization:

يوضع الغشاء المثبت عليه الدنا في وسط سائل على تماس مع مسبر (قطعة من الدنا مفردة السلسلة مكونة من تسلسل نوكليوتيدي معيّن موسوم، يرتبط إلى التسلسل المتمم له في الـدنا المثبت على الغشاء). ويكون المسبر موسوماً إما بالعناصر المشعة (كالفسفور P35)؛ وإمّا باستخدام صبغات يمكن كشفها بالتلوين الكيميائي chromogenic أو بالفلورة (التوهج) fluorescence؛ مما يسمح بتعرّف مكان وجوده على الغشاء لاحقاً. قد يتكون المسبر -في بعض الحالات- من الحمض الريبي النووي (الرنا) Ribonucleic Acid (RNA) بدلاً من دنا. تستخدم أغلب طرائق التهجين الجزيئية دنا مستخلصاً من الحيوانات المنوية لأسماك السلمون salmon أو أسماك الرنجة herring، وذلك لتغطية كل مناطق الغشاء الخالية من الـدنا المراد دراسته، وكذلك الفورم أميد المنزوع الإيونات (الشوارد)، والمواد المنظفة detergents مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم Sodium dodecyl Sulfate (SDS) للتخفيف من الارتباطات غير النوعية مع المسبر ولضمان ارتباط المسبر بقوة مع التسلسل النوكليوتيدي المتمم له (الهدف) والمثبت على الغشاء. وبعد نهاية عملية التهجين يُزال الفائض من المسبر عن الغشاء بغسله بمحاليل ملحية منخفضة التركيز وبوجود مواد منظفة وبدرجات حرارة مرتفعة، ويُترك الغشاء ليجف بين طبقتين من أوراق الترشيح.

5- الكشف عن نتائج التهجين detection of hybridization results:

يوضع الغشاء على تماس مع فلم الأشعة السينية، ويُتْرَك في الظلام بدرجة حرارة منخفضة فترة زمنية محددة، ثم يُظَهَّر الفيلم لرؤية النتائج (بحال استخدام مسبر موسوم بالعناصر المشعة أو المتوهجة)، أو يُظَهَّر اللون على الغشاء مباشرة بحال استخدام طرائق الكشف اللونية، حيث تظهر النتائج على شكل حزم غامقة.

6- تحليل النتائج:

يرتبط دنا المسبر بقطعة دنا مثبتة على الغشاء اعتماداً على التتامية بينهما، وهو ما يمثل عملية التهجين الجزيئي. وتفسر النتائج بأن الحزمة التي تظهر على فلم الأشعة السينية تحوي شدفاً متممة للمسبر، وبما أن شدف الـدنا على الغشاء هي القطع التي نُقِلَت من الهلامة بعد نهاية الرحلان الكهربائي؛ فيمكن تحديد قطعة الـدنا التي تحوي التسلسل المكمل للمسبر بدقة ومكان وجودها على الهلامة (الشكل 2).

الشكل (2) نتائج عمليتي الرحلان الكهربائي والتهجين الجزيئي.

 

استخدمت طريقة تشرب ساوذرن بعدد من التطبيقات المهمّة، حيث أمكن من خلالها:

- تحديد البصمة الوراثية، أو بصمة الـدنا DNA fingerprint عند الإنسان، ويكون ذلك بالاعتماد على مناطق من المجين مكونة من وحدات قصيرة مؤلفة من عدة نوكليوتيدات مرتبة وراء بعضها بشكل مترادف وبأعداد مختلفة وبمناطق متعددة على المجين Variable Number of Tandem Repeats، وتسمى المؤشرات الناجمة عنها VNTR، ويمكن استخدامها للتعرف إلى هوية الأفراد ولكشف الجرائم وباختبارات معرفة النسب والتعرف إلى الأطفال والمواليد المفقودين في المستشفيات وغيرها.

- البحث عن جين معيّن في كائن ما، مثل الجينات التي تمنح بعض النباتات المقاومة لبعض الأمراض؛ اعتماداً على التشابه بتركيبها النوكليوتيدي مع جين معروف الوظيفة ومعزول من كائن آخر يستخدم مسبراً موسوماً.

- تحديد عدد نسخ جين ما gene copies في مجين الكائن المدروس، وتطبق عند إنتاج النباتات المُحَوَّرة وراثياً لمعرفة عدد نسخ الجين التي وصلت إلى الكائن المحوَّر.

- تحديد درجات القرابة الوراثية بين الكائنات المختلفة من خلال التحكم بظروف غسل الأغشية، من تغيير بدرجات الحرارة (رفعها) أو تغيير بتركيز الأملاح (خفضها)، حيث كلما قل البعد الوراثي بين جزيئات الـدنا المهجَّنة فإنها تحافظ على ارتباطها بظروف الغسل القاسية.

- غربلة المكتبات المجينية genomic library screening، والتعرف إلى النسيلات التي تحمل الجين المرغوب والناجم عن عمليات التنسيل cloning.

- كشف أنواع مختلفة من الطفرات، مثل تلك الناجمة عن حذف بعض النوكليوتيدات أو إضافتها، أو إعادة ترتيب مقاطع المورثة، والتي قد تكون السبب بالإصابة بأمراض جينية (وراثية) معيّنة.

- التعرف إلى المواقع المُمَيْتَلة methylated sites على بعض الجينات.

- التشخيص المبكر لبعض أنواع السرطانات مثل ابيضاض الدم leukemias، أو بعض الأمراض الجينية عند الآباء ودراسة انتقالها إلى الأبناء.

مراجع للاستزادة: - J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. - E.D. Southern, Southern Blotting, Nature Protocols 2006. - R.F. Weaver, Molecular Biology, MGrow-Hill International Edition. New York, 2008.

---

- التصنيف : الوراثة والتقانات الحيوية - النوع : الوراثة والتقانات الحيوية - المجلد : المجلد الثامن مشاركة :